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IP 和 flow cytometry的结果不一致
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h*k
2
在cell line上表达A receptor, 用B蛋白IP, A 能被pull down. 但是用B蛋白染色这个
表达A receptor的 cell line却染不上,有人遇到过这种情况吗?如何解释?
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T*e
3
建议楼主把"但是用B蛋白染色这个表达A receptor的 cell line却染不上"和"flow
cytometry"解释清楚一些,我反正没看懂这是什么意思
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h*k
4
不好意思,没写清楚。这个实验我用B蛋白和表达A receptor的cell line一起incubate
, 然后加识别B蛋白的二抗(带荧光),最后在流式细胞仪(flow cytometry)上跑。表
达A receptor的cell line没有被B蛋白stain.

【在 T*****e 的大作中提到】
: 建议楼主把"但是用B蛋白染色这个表达A receptor的 cell line却染不上"和"flow
: cytometry"解释清楚一些,我反正没看懂这是什么意思

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w*3
5
Surface staining? What if it is intracellular?

incubate
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.2

【在 h****k 的大作中提到】
: 不好意思,没写清楚。这个实验我用B蛋白和表达A receptor的cell line一起incubate
: , 然后加识别B蛋白的二抗(带荧光),最后在流式细胞仪(flow cytometry)上跑。表
: 达A receptor的cell line没有被B蛋白stain.

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h*k
6
是的,因为是receptor所以就只做了surface staining,我没有试过intracellular
stain, 可以试一下,不过fix这一步可能会提高non-specific staining

【在 w*********3 的大作中提到】
: Surface staining? What if it is intracellular?
:
: incubate
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.2

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T*e
7
我总结一下楼主的实验,看看我有没有理解:
1. 在某细胞系中有B蛋白,楼主在其中表达一个A receptor,并假定AB有直接的蛋白相
互作用(连接)。于是楼主做co-IP,用识别B蛋白的抗体拉复合物,在该复合物中可以
检测到A蛋白(抗体识别,我自己脑补的)。
2. 楼主想进一步验证该结合,或者其他目的(筛选,测序等等)。于是在上述细胞系
中(有B蛋白,部分细胞可能转染了A receptor),对该细胞系进行染色(我不知道什
么是surface staining),楼主默认B蛋白在细胞膜上(我脑补的),所以该染色可以
标记所有带B蛋白的细胞,又因为B蛋白和A receptor结合,所以楼主认为在收到的B蛋
白阳性的细胞中应该有A receptor表达,于是检测A receptor,但无法检测到结果。
我对此有如下问题:
1. B蛋白在细胞膜上吗?
2. 在该细胞系中B蛋白是稳定表达的吗?每个细胞?每个时刻?
3. 楼主在实验2中如何检测A receptor?WB?
我看不出来IP的结果为什么能说明表达B蛋白的细胞中一定有A receptor的表达。
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D*a
8
B蛋白没有agonist吗,或者是的突变过的B蛋白,那种结合下去不下来的。你自然的B蛋
白谁知道它怎么作用的
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h*k
9
不好意思。 B蛋白是纯化后的重组蛋白,我们觉得它可能是A receptor的ligand..A
receptor表达在细胞膜上,A receptor有加了tag, 用anti-tag antibody染色做流式细
胞仪检测到的。

【在 T*****e 的大作中提到】
: 我总结一下楼主的实验,看看我有没有理解:
: 1. 在某细胞系中有B蛋白,楼主在其中表达一个A receptor,并假定AB有直接的蛋白相
: 互作用(连接)。于是楼主做co-IP,用识别B蛋白的抗体拉复合物,在该复合物中可以
: 检测到A蛋白(抗体识别,我自己脑补的)。
: 2. 楼主想进一步验证该结合,或者其他目的(筛选,测序等等)。于是在上述细胞系
: 中(有B蛋白,部分细胞可能转染了A receptor),对该细胞系进行染色(我不知道什
: 么是surface staining),楼主默认B蛋白在细胞膜上(我脑补的),所以该染色可以
: 标记所有带B蛋白的细胞,又因为B蛋白和A receptor结合,所以楼主认为在收到的B蛋
: 白阳性的细胞中应该有A receptor表达,于是检测A receptor,但无法检测到结果。
: 我对此有如下问题:

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l*i
10
毕竟B不是抗体,在不知道A,B相互作用强弱的情况下用flow很难检测到,相对于flow
,IP后用WB检查具有更高的sensitivity,并且很多非特异作用的蛋白,可以通过分子
量大小与目标蛋白区别开,而这些非特异的background,在flow染色和检测中仍然存在
。我建议你可以考虑尝试类似于ELISA的检测方法。
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c*n
11
如果非要做流式,换成B的tetramer或者pentamer做也许可以。表面受体和ligand的
affinity一般都不高,很多都是到uM级别。
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s*g
12
IP/WB
免疫荧光照相(活体或固定的)
流矢细胞检测虽然快,但我总觉得不敏感。容易有非特异染色干扰。
最近我也在探讨两个信号分子在细胞膜上是否有co-localization。很不容易。因为悬
浮细胞,而且是快速反应。。。
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v*m
13
pull down: A~x1~x2~xn~B, A'~B or the combos of both in the whole lysate.
cell surface, only A extracellular domains at certain conformation are
available for B.
plus, binding kinetics is different between these two.
Binding is a sum of chemical interactions. These experiments need more
elaborated
ideas.

B
stain

【在 h****k 的大作中提到】
: 在cell line上表达A receptor, 用B蛋白IP, A 能被pull down. 但是用B蛋白染色这个
: 表达A receptor的 cell line却染不上,有人遇到过这种情况吗?如何解释?

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