大家克隆promoter都用什么方法？谢谢！# Biology - 生物学
s*a
1 楼
有一个3kb的promoter需要克隆，然后连到pGL4里面。大家都是怎么克隆的？想直接找
公司合成，查了一下得八九百，有点贵。
谢谢！
公司合成，查了一下得八九百，有点贵。
谢谢！
w*e
2 楼
3K直接pcr应该不难吧，就用genomic dna
D*a
3 楼
从bac上同源重组？
n*w
4 楼
从bac上找看能不能用酶切
r*g
5 楼
对啊，3kb直接pcr啊
【在 w*e 的大作中提到】
: 3K直接pcr应该不难吧，就用genomic dna
【在 w*e 的大作中提到】
: 3K直接pcr应该不难吧，就用genomic dna
x*e
6 楼
你有bac同源重组的protocol吗
【在 D*a 的大作中提到】
: 从bac上同源重组？
【在 D*a 的大作中提到】
: 从bac上同源重组？
x*e
7 楼
3k的promoter sequence普通pcr应该没有难度，用BAC作为template。主要是看看序列
里哪些酶切位点不能用了。如果实在找不到可用的酶切位点，可以用Gibson assembly
连到载体里。3k的序列，像我这种手残星人都能搞定。
【在 s**********a 的大作中提到】
: 有一个3kb的promoter需要克隆，然后连到pGL4里面。大家都是怎么克隆的？想直接找
: 公司合成，查了一下得八九百，有点贵。
: 谢谢！
里哪些酶切位点不能用了。如果实在找不到可用的酶切位点，可以用Gibson assembly
连到载体里。3k的序列，像我这种手残星人都能搞定。
【在 s**********a 的大作中提到】
: 有一个3kb的promoter需要克隆，然后连到pGL4里面。大家都是怎么克隆的？想直接找
: 公司合成，查了一下得八九百，有点贵。
: 谢谢！
s*y
8 楼
你的问lz基因组序列是已知的还是未知的先
其实3k弄出来的办法多的是，就是啥也不知道的情况下，用最笨的genome walking或者
tail pcr运气好也用不了几下就出来了，已知序列直接高保真酶PCR
【在 x********e 的大作中提到】
: 你有bac同源重组的protocol吗
其实3k弄出来的办法多的是，就是啥也不知道的情况下，用最笨的genome walking或者
tail pcr运气好也用不了几下就出来了，已知序列直接高保真酶PCR
【在 x********e 的大作中提到】
: 你有bac同源重组的protocol吗
x*e
9 楼
人都想合成了，应该是已知的吧
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的问lz基因组序列是已知的还是未知的先
: 其实3k弄出来的办法多的是，就是啥也不知道的情况下，用最笨的genome walking或者
: tail pcr运气好也用不了几下就出来了，已知序列直接高保真酶PCR
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的问lz基因组序列是已知的还是未知的先
: 其实3k弄出来的办法多的是，就是啥也不知道的情况下，用最笨的genome walking或者
: tail pcr运气好也用不了几下就出来了，已知序列直接高保真酶PCR
x*e
10 楼
如果8k以上用什么办法比较好？8k以上的我就没成功过。。。
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的问lz基因组序列是已知的还是未知的先
: 其实3k弄出来的办法多的是，就是啥也不知道的情况下，用最笨的genome walking或者
: tail pcr运气好也用不了几下就出来了，已知序列直接高保真酶PCR
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的问lz基因组序列是已知的还是未知的先
: 其实3k弄出来的办法多的是，就是啥也不知道的情况下，用最笨的genome walking或者
: tail pcr运气好也用不了几下就出来了，已知序列直接高保真酶PCR
s*a
11 楼
谢谢大家的回复。
我们没有BCA library。可以用qiagen的kit从细胞中提取genomic DNA做模版么？
另外primer出了酶切位点之外还有其他要求么？扩出片段之后是直接酶切还是先连载体
如T载体再酶切。
有什么保真酶推荐么？
谢谢！
我们没有BCA library。可以用qiagen的kit从细胞中提取genomic DNA做模版么？
另外primer出了酶切位点之外还有其他要求么？扩出片段之后是直接酶切还是先连载体
如T载体再酶切。
有什么保真酶推荐么？
谢谢！
s*a
12 楼
谢谢！
序列已知！
请问你们用的哪家的酶？
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的问lz基因组序列是已知的还是未知的先
: 其实3k弄出来的办法多的是，就是啥也不知道的情况下，用最笨的genome walking或者
: tail pcr运气好也用不了几下就出来了，已知序列直接高保真酶PCR
序列已知！
请问你们用的哪家的酶？
【在 s******y 的大作中提到】
: 你的问lz基因组序列是已知的还是未知的先
: 其实3k弄出来的办法多的是，就是啥也不知道的情况下，用最笨的genome walking或者
: tail pcr运气好也用不了几下就出来了，已知序列直接高保真酶PCR
j*n
13 楼
应该没问题吧 很直接的操作
promoter 可能ta含量高 需要优化下pcr条件
polymerase无脑推荐q5
贵点 但基本没啥缺点 除了不能直接做ta克隆
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.3
【在 s**********a 的大作中提到】
: 谢谢大家的回复。
: 我们没有BCA library。可以用qiagen的kit从细胞中提取genomic DNA做模版么？
: 另外primer出了酶切位点之外还有其他要求么？扩出片段之后是直接酶切还是先连载体
: 如T载体再酶切。
: 有什么保真酶推荐么？
: 谢谢！
promoter 可能ta含量高 需要优化下pcr条件
polymerase无脑推荐q5
贵点 但基本没啥缺点 除了不能直接做ta克隆
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.3
【在 s**********a 的大作中提到】
: 谢谢大家的回复。
: 我们没有BCA library。可以用qiagen的kit从细胞中提取genomic DNA做模版么？
: 另外primer出了酶切位点之外还有其他要求么？扩出片段之后是直接酶切还是先连载体
: 如T载体再酶切。
: 有什么保真酶推荐么？
: 谢谢！
D*a
14 楼
我们以前是用的这个paper的方法。不过好多年没碰了，应该有改进了。现在感觉很多
人做老鼠都用这类的方法。
8k以上肯定得用这个了，PCR查mutation要死了。当时虽然我只是打工不负责动脑子，
不过我感觉，挺好做的。
http://genome.cshlp.org/content/13/3/476.long
【在 x********e 的大作中提到】
: 如果8k以上用什么办法比较好？8k以上的我就没成功过。。。
人做老鼠都用这类的方法。
8k以上肯定得用这个了，PCR查mutation要死了。当时虽然我只是打工不负责动脑子，
不过我感觉，挺好做的。
http://genome.cshlp.org/content/13/3/476.long
【在 x********e 的大作中提到】
: 如果8k以上用什么办法比较好？8k以上的我就没成功过。。。
x*e
15 楼
8k以上我胶回收和ligation都有问题，看来必须上recombineering了。谢谢
【在 D*a 的大作中提到】
: 我们以前是用的这个paper的方法。不过好多年没碰了，应该有改进了。现在感觉很多
: 人做老鼠都用这类的方法。
: 8k以上肯定得用这个了，PCR查mutation要死了。当时虽然我只是打工不负责动脑子，
: 不过我感觉，挺好做的。
: http://genome.cshlp.org/content/13/3/476.long
【在 D*a 的大作中提到】
: 我们以前是用的这个paper的方法。不过好多年没碰了，应该有改进了。现在感觉很多
: 人做老鼠都用这类的方法。
: 8k以上肯定得用这个了，PCR查mutation要死了。当时虽然我只是打工不负责动脑子，
: 不过我感觉，挺好做的。
: http://genome.cshlp.org/content/13/3/476.long
j*n
16 楼
可以用gibson assembly 搞过20k的
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.3
【在 x********e 的大作中提到】
: 8k以上我胶回收和ligation都有问题，看来必须上recombineering了。谢谢
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.3
【在 x********e 的大作中提到】
: 8k以上我胶回收和ligation都有问题，看来必须上recombineering了。谢谢
s*y
17 楼
8k以上老帮菜喜欢用酶切方法，新出道的一般就是kit重组
【在 x********e 的大作中提到】
: 如果8k以上用什么办法比较好？8k以上的我就没成功过。。。
【在 x********e 的大作中提到】
: 如果8k以上用什么办法比较好？8k以上的我就没成功过。。。
r*g
18 楼
纯好奇
从来没clone这么大的
我在网上看过12kb的clone，不知道 5 - 12kb的怎么screen mutation呢？ 用sanger一
段一段的爬么？
【在 x********e 的大作中提到】
: 如果8k以上用什么办法比较好？8k以上的我就没成功过。。。
从来没clone这么大的
我在网上看过12kb的clone，不知道 5 - 12kb的怎么screen mutation呢？ 用sanger一
段一段的爬么？
【在 x********e 的大作中提到】
: 如果8k以上用什么办法比较好？8k以上的我就没成功过。。。
x*e
19 楼
我试过2fragment assembly，不成功。你同源arm多长？
【在 j****n 的大作中提到】
: 可以用gibson assembly 搞过20k的
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.3
【在 j****n 的大作中提到】
: 可以用gibson assembly 搞过20k的
:
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.3
s*y
20 楼
一把引物撒下去，一下就出来了，就算你一个反应测6-800bp有效距离
再说从BAC库搞下来的突变不高的
【在 r******g 的大作中提到】
: 纯好奇
: 从来没clone这么大的
: 我在网上看过12kb的clone，不知道 5 - 12kb的怎么screen mutation呢？ 用sanger一
: 段一段的爬么？
再说从BAC库搞下来的突变不高的
【在 r******g 的大作中提到】
: 纯好奇
: 从来没clone这么大的
: 我在网上看过12kb的clone，不知道 5 - 12kb的怎么screen mutation呢？ 用sanger一
: 段一段的爬么？
j*n
21 楼
我只有一个大片段 homology arm我一般都是搞25bp的样子
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【在 x********e 的大作中提到】
: 我试过2fragment assembly，不成功。你同源arm多长？
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.3
【在 x********e 的大作中提到】
: 我试过2fragment assembly，不成功。你同源arm多长？
j*n
22 楼
补充一点 如果最终plasmid比较大，
不要用自带的competent cell
推荐neb 10beta 适用于扩增大plasmid 效率也更高
neb turbo也不错 适合像我这种不喜欢做电转的
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.3
【在 x********e 的大作中提到】
: 我试过2fragment assembly，不成功。你同源arm多长？
不要用自带的competent cell
推荐neb 10beta 适用于扩增大plasmid 效率也更高
neb turbo也不错 适合像我这种不喜欢做电转的
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【在 x********e 的大作中提到】
: 我试过2fragment assembly，不成功。你同源arm多长？
n*w
23 楼
酶切吧 刚从bac里整了个9kb的
【在 x********e 的大作中提到】
: 8k以上我胶回收和ligation都有问题，看来必须上recombineering了。谢谢
【在 x********e 的大作中提到】
: 8k以上我胶回收和ligation都有问题，看来必须上recombineering了。谢谢
x*e
24 楼
没有合适的酶
【在 n***w 的大作中提到】
: 酶切吧 刚从bac里整了个9kb的
【在 n***w 的大作中提到】
: 酶切吧 刚从bac里整了个9kb的
m*D
25 楼
我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
低点，3-5度。
genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
就够用20-50次PCR了。
我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
可以用两个不同的酶来克隆。Sal I是老鼠和人genome里少见的酶位点，我几乎每次都
能用上。其他的看运气，识别8 nt的酶有时用，但很多vector不带这种位点。
如果是大的片断，象下悬月的，没有合适的酶，一般可以考虑把片断打成两截。如果是
8kb,我会考虑成3/5kb两个，方便gel区分。中间找一个single cut list上的酶，两端
和vector接口的用不同的酶。PCR完后，酶切，gel纯化后。vector,两个PCR fragments
直接连接。
连接的kit,我喜欢Roche的Rapid DNA ligation kit.我一般室温下两小时，就
transformation.两片断三片断四片断度都这个kit作过，都是一次解决。
片断不大，保证整个plasmid在10kb以下，任何vector都差不多。对大的片断，我喜欢
用puc18/19。这里面我克隆过的最大是20kb.它可以用laz的蓝白斑筛选，对克隆10kb以
上的，会很有用。
对大于15kb的plasmid 的transformation有一些讲究。机械切DNA（vortex,pipetting)
的大小在20kb左右，所以，这么大的plasmid，尽量用大口的枪头；混合DNA和
competent cell，尽量不要用枪头，而是轻轻手摇试管。我喜欢用BD的falcon 352051
试管。
作酶式的克隆，NEB的catalog是一本很好的参考书。它的reference appendex是克隆的
经典。这些是常用的：compatible cohensive ends, alphabetical list of
recognition seq., methylation sensitivity, Cleavage close to the end of DNA
fragment...
到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
低点，3-5度。
genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
就够用20-50次PCR了。
我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
可以用两个不同的酶来克隆。Sal I是老鼠和人genome里少见的酶位点，我几乎每次都
能用上。其他的看运气，识别8 nt的酶有时用，但很多vector不带这种位点。
如果是大的片断，象下悬月的，没有合适的酶，一般可以考虑把片断打成两截。如果是
8kb,我会考虑成3/5kb两个，方便gel区分。中间找一个single cut list上的酶，两端
和vector接口的用不同的酶。PCR完后，酶切，gel纯化后。vector,两个PCR fragments
直接连接。
连接的kit,我喜欢Roche的Rapid DNA ligation kit.我一般室温下两小时，就
transformation.两片断三片断四片断度都这个kit作过，都是一次解决。
片断不大，保证整个plasmid在10kb以下，任何vector都差不多。对大的片断，我喜欢
用puc18/19。这里面我克隆过的最大是20kb.它可以用laz的蓝白斑筛选，对克隆10kb以
上的，会很有用。
对大于15kb的plasmid 的transformation有一些讲究。机械切DNA（vortex,pipetting)
的大小在20kb左右，所以，这么大的plasmid，尽量用大口的枪头；混合DNA和
competent cell，尽量不要用枪头，而是轻轻手摇试管。我喜欢用BD的falcon 352051
试管。
作酶式的克隆，NEB的catalog是一本很好的参考书。它的reference appendex是克隆的
经典。这些是常用的：compatible cohensive ends, alphabetical list of
recognition seq., methylation sensitivity, Cleavage close to the end of DNA
fragment...
j*n
26 楼
赞纯技术帖 现在很难找到这种老熟练工了 毕竟新方法更能解决多片段大片段克隆 但
同时也忽视了一些最基本的training
这个和miniprep 类似，新学生应该没几个知道buffer 1/2/3啥成分了
现在实验室 估计两片段ligation都没多少人愿意挑战了
Taq
well
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.4
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
同时也忽视了一些最基本的training
这个和miniprep 类似，新学生应该没几个知道buffer 1/2/3啥成分了
现在实验室 估计两片段ligation都没多少人愿意挑战了
Taq
well
★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.4
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
r*g
27 楼
从来没克隆过这么大的，问个naive question
你如果用hifi的 酶，12-20kb 也要出现好多mutation了吧？
你们筛clone的mutation, 难道 直接一段一段的用sanger seq爬么？ 怎么优化这
个步骤呢？
是不是BAC更适合克隆大片段？
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
你如果用hifi的 酶，12-20kb 也要出现好多mutation了吧？
你们筛clone的mutation, 难道 直接一段一段的用sanger seq爬么？ 怎么优化这
个步骤呢？
是不是BAC更适合克隆大片段？
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
s*y
28 楼
做克隆不得不服，还是老帮菜厉害
虽然我很久不做实验，但是弄个几k的片段亚克隆之类的肯定把弦乐这种秒哭没问题，哈
哈哈
【在 j****n 的大作中提到】
: 赞纯技术帖 现在很难找到这种老熟练工了 毕竟新方法更能解决多片段大片段克隆 但
: 同时也忽视了一些最基本的training
: 这个和miniprep 类似，新学生应该没几个知道buffer 1/2/3啥成分了
: 现在实验室 估计两片段ligation都没多少人愿意挑战了
:
: Taq
: well
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.4
虽然我很久不做实验，但是弄个几k的片段亚克隆之类的肯定把弦乐这种秒哭没问题，哈
哈哈
【在 j****n 的大作中提到】
: 赞纯技术帖 现在很难找到这种老熟练工了 毕竟新方法更能解决多片段大片段克隆 但
: 同时也忽视了一些最基本的training
: 这个和miniprep 类似，新学生应该没几个知道buffer 1/2/3啥成分了
: 现在实验室 估计两片段ligation都没多少人愿意挑战了
:
: Taq
: well
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.4
D*a
29 楼
所以还是recombineering好用啊。
【在 r******g 的大作中提到】
: 从来没克隆过这么大的，问个naive question
: 你如果用hifi的 酶，12-20kb 也要出现好多mutation了吧？
: 你们筛clone的mutation, 难道 直接一段一段的用sanger seq爬么？ 怎么优化这
: 个步骤呢？
: 是不是BAC更适合克隆大片段？
:
: Taq
: well
【在 r******g 的大作中提到】
: 从来没克隆过这么大的，问个naive question
: 你如果用hifi的 酶，12-20kb 也要出现好多mutation了吧？
: 你们筛clone的mutation, 难道 直接一段一段的用sanger seq爬么？ 怎么优化这
: 个步骤呢？
: 是不是BAC更适合克隆大片段？
:
: Taq
: well
d*i
30 楼
以前做过一个promoter，从genomic DNA PCR很困难，做不出来，后来从BAC里面一把搞
定了。楼主要是能买到BAC还是用BAC做模版吧。
只是我不知道怎么找到含有这个promoter的BAC。哪位大神知道给科普一下。
定了。楼主要是能买到BAC还是用BAC做模版吧。
只是我不知道怎么找到含有这个promoter的BAC。哪位大神知道给科普一下。
s*y
31 楼
筛库啊，老帮菜都会，最经典的是同位素southern筛。当然，也可以用PCR筛。
【在 d****i 的大作中提到】
: 以前做过一个promoter，从genomic DNA PCR很困难，做不出来，后来从BAC里面一把搞
: 定了。楼主要是能买到BAC还是用BAC做模版吧。
: 只是我不知道怎么找到含有这个promoter的BAC。哪位大神知道给科普一下。
【在 d****i 的大作中提到】
: 以前做过一个promoter，从genomic DNA PCR很困难，做不出来，后来从BAC里面一把搞
: 定了。楼主要是能买到BAC还是用BAC做模版吧。
: 只是我不知道怎么找到含有这个promoter的BAC。哪位大神知道给科普一下。
s*v
32 楼
Agree.
It is not that easy as some people thought to amplify a promoter sequence by
PCR, especially with a low quality template. Lots of high GC repeats and
complex higher order structure. You might even get trouble to sequence it
after you amplify the sequence.
【在 d****i 的大作中提到】
: 以前做过一个promoter，从genomic DNA PCR很困难，做不出来，后来从BAC里面一把搞
: 定了。楼主要是能买到BAC还是用BAC做模版吧。
: 只是我不知道怎么找到含有这个promoter的BAC。哪位大神知道给科普一下。
It is not that easy as some people thought to amplify a promoter sequence by
PCR, especially with a low quality template. Lots of high GC repeats and
complex higher order structure. You might even get trouble to sequence it
after you amplify the sequence.
【在 d****i 的大作中提到】
: 以前做过一个promoter，从genomic DNA PCR很困难，做不出来，后来从BAC里面一把搞
: 定了。楼主要是能买到BAC还是用BAC做模版吧。
: 只是我不知道怎么找到含有这个promoter的BAC。哪位大神知道给科普一下。
x*e
33 楼
赞长帖！我觉得克隆看似简单里面却有很多小技巧，以后要多向你请教请教。
我那个8k序列，我也试过分两段克隆。两个片段都放TA vector里了，切一个片段下来
，死活连不到另外一个上面去。设计应该没问题。挑菌落小提以后只有带一个片段的载
体。我们实验室的技术员最近帮另一个人做分子克隆，也是一样的问题。
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
我那个8k序列，我也试过分两段克隆。两个片段都放TA vector里了，切一个片段下来
，死活连不到另外一个上面去。设计应该没问题。挑菌落小提以后只有带一个片段的载
体。我们实验室的技术员最近帮另一个人做分子克隆，也是一样的问题。
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
x*e
34 楼
不成功可能跟我载体也有关。我的连接产物都在12k以上，用的普通NEB competent
cells
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
cells
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
x*e
35 楼
我配过大提buffer，还记得P1/2/3的区别。两片段liagation做过，做不出来。
【在 j****n 的大作中提到】
: 赞纯技术帖 现在很难找到这种老熟练工了 毕竟新方法更能解决多片段大片段克隆 但
: 同时也忽视了一些最基本的training
: 这个和miniprep 类似，新学生应该没几个知道buffer 1/2/3啥成分了
: 现在实验室 估计两片段ligation都没多少人愿意挑战了
:
: Taq
: well
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.4
【在 j****n 的大作中提到】
: 赞纯技术帖 现在很难找到这种老熟练工了 毕竟新方法更能解决多片段大片段克隆 但
: 同时也忽视了一些最基本的training
: 这个和miniprep 类似，新学生应该没几个知道buffer 1/2/3啥成分了
: 现在实验室 估计两片段ligation都没多少人愿意挑战了
:
: Taq
: well
: ★ 发自iPhone App: ChineseWeb 1.0.4
m*D
36 楼
最近还作了一个3 KB的，三对primer，两对出来。clone后seq,只有两个Nt和database
里的不match.考虑SNP的话，PCR mutation应该不是问题。
【在 r******g 的大作中提到】
: 从来没克隆过这么大的，问个naive question
: 你如果用hifi的 酶，12-20kb 也要出现好多mutation了吧？
: 你们筛clone的mutation, 难道 直接一段一段的用sanger seq爬么？ 怎么优化这
: 个步骤呢？
: 是不是BAC更适合克隆大片段？
:
: Taq
: well
里的不match.考虑SNP的话，PCR mutation应该不是问题。
【在 r******g 的大作中提到】
: 从来没克隆过这么大的，问个naive question
: 你如果用hifi的 酶，12-20kb 也要出现好多mutation了吧？
: 你们筛clone的mutation, 难道 直接一段一段的用sanger seq爬么？ 怎么优化这
: 个步骤呢？
: 是不是BAC更适合克隆大片段？
:
: Taq
: well
x*e
37 楼
我本科做cDNA克隆突变一点问题都没有。现在搞intronic sequence，被虐得一点信心
都没有了。。。
，哈
【在 s******y 的大作中提到】
: 做克隆不得不服，还是老帮菜厉害
: 虽然我很久不做实验，但是弄个几k的片段亚克隆之类的肯定把弦乐这种秒哭没问题，哈
: 哈哈
都没有了。。。
，哈
【在 s******y 的大作中提到】
: 做克隆不得不服，还是老帮菜厉害
: 虽然我很久不做实验，但是弄个几k的片段亚克隆之类的肯定把弦乐这种秒哭没问题，哈
: 哈哈
m*D
38 楼
别笑话年青人。他们对新东西的掌握还是比我们快的。
，哈
【在 s******y 的大作中提到】
: 做克隆不得不服，还是老帮菜厉害
: 虽然我很久不做实验，但是弄个几k的片段亚克隆之类的肯定把弦乐这种秒哭没问题，哈
: 哈哈
，哈
【在 s******y 的大作中提到】
: 做克隆不得不服，还是老帮菜厉害
: 虽然我很久不做实验，但是弄个几k的片段亚克隆之类的肯定把弦乐这种秒哭没问题，哈
: 哈哈
m*D
39 楼
不至于吧。20年前我就搞出来10Kb了。有时候要试试不同的primer set，我一般是至少
一头两个primer，组合就有四对了，同时试，看哪个有产物。Primer有不贵，几块钱的
事。上面有网友推荐的Q，是用来对付high GC的，值得一试。
by
【在 s*****v 的大作中提到】
: Agree.
: It is not that easy as some people thought to amplify a promoter sequence by
: PCR, especially with a low quality template. Lots of high GC repeats and
: complex higher order structure. You might even get trouble to sequence it
: after you amplify the sequence.
一头两个primer，组合就有四对了，同时试，看哪个有产物。Primer有不贵，几块钱的
事。上面有网友推荐的Q，是用来对付high GC的，值得一试。
by
【在 s*****v 的大作中提到】
: Agree.
: It is not that easy as some people thought to amplify a promoter sequence by
: PCR, especially with a low quality template. Lots of high GC repeats and
: complex higher order structure. You might even get trouble to sequence it
: after you amplify the sequence.
x*e
40 楼
你再说说怎么设计引物吧。我用BAC做模板p，还是有很多杂带。我对promoter/
intronic sequence的克隆一点经验都没有。
database
【在 m*********D 的大作中提到】
: 最近还作了一个3 KB的，三对primer，两对出来。clone后seq,只有两个Nt和database
: 里的不match.考虑SNP的话，PCR mutation应该不是问题。
intronic sequence的克隆一点经验都没有。
database
【在 m*********D 的大作中提到】
: 最近还作了一个3 KB的，三对primer，两对出来。clone后seq,只有两个Nt和database
: 里的不match.考虑SNP的话，PCR mutation应该不是问题。
m*D
41 楼
12kb应该可以，commercial的competent cell应该可以了。我都用我们这里facility作
的competent cell来作克隆（10bucks/ 1 ml)。只有作mutagenesis或大于15Kb的时候
才用commercial的。
死活作不出来的，我会换vestor.一种考虑就是克隆进去的这个片断产生有毒的protein
。这种概率不大，但有可能。
【在 x********e 的大作中提到】
: 不成功可能跟我载体也有关。我的连接产物都在12k以上，用的普通NEB competent
: cells
:
: Taq
: well
的competent cell来作克隆（10bucks/ 1 ml)。只有作mutagenesis或大于15Kb的时候
才用commercial的。
死活作不出来的，我会换vestor.一种考虑就是克隆进去的这个片断产生有毒的protein
。这种概率不大，但有可能。
【在 x********e 的大作中提到】
: 不成功可能跟我载体也有关。我的连接产物都在12k以上，用的普通NEB competent
: cells
:
: Taq
: well
x*e
42 楼
我决定试bac recombineering了。要做的东西不少，每个片段都这样struggle太痛苦了
。。。
protein
【在 m*********D 的大作中提到】
: 12kb应该可以，commercial的competent cell应该可以了。我都用我们这里facility作
: 的competent cell来作克隆（10bucks/ 1 ml)。只有作mutagenesis或大于15Kb的时候
: 才用commercial的。
: 死活作不出来的，我会换vestor.一种考虑就是克隆进去的这个片断产生有毒的protein
: 。这种概率不大，但有可能。
。。。
protein
【在 m*********D 的大作中提到】
: 12kb应该可以，commercial的competent cell应该可以了。我都用我们这里facility作
: 的competent cell来作克隆（10bucks/ 1 ml)。只有作mutagenesis或大于15Kb的时候
: 才用commercial的。
: 死活作不出来的，我会换vestor.一种考虑就是克隆进去的这个片断产生有毒的protein
: 。这种概率不大，但有可能。
s*y
43 楼
............
cDNA克隆是克隆的入门级别吧。map亚克隆，大片段的装载才是关键。天天用kit的小白
，抽个能用的BAC质粒就能搞哭你说的那种cDNA克隆。
【在 x********e 的大作中提到】
: 我本科做cDNA克隆突变一点问题都没有。现在搞intronic sequence，被虐得一点信心
: 都没有了。。。
:
: ，哈
cDNA克隆是克隆的入门级别吧。map亚克隆，大片段的装载才是关键。天天用kit的小白
，抽个能用的BAC质粒就能搞哭你说的那种cDNA克隆。
【在 x********e 的大作中提到】
: 我本科做cDNA克隆突变一点问题都没有。现在搞intronic sequence，被虐得一点信心
: 都没有了。。。
:
: ，哈
V*t
44 楼
请问这个 帖子里面
克隆8K的promoter 目的一般是什么实验？
【在 x********e 的大作中提到】
: 赞长帖！我觉得克隆看似简单里面却有很多小技巧，以后要多向你请教请教。
: 我那个8k序列，我也试过分两段克隆。两个片段都放TA vector里了，切一个片段下来
: ，死活连不到另外一个上面去。设计应该没问题。挑菌落小提以后只有带一个片段的载
: 体。我们实验室的技术员最近帮另一个人做分子克隆，也是一样的问题。
:
: Taq
: well
克隆8K的promoter 目的一般是什么实验？
【在 x********e 的大作中提到】
: 赞长帖！我觉得克隆看似简单里面却有很多小技巧，以后要多向你请教请教。
: 我那个8k序列，我也试过分两段克隆。两个片段都放TA vector里了，切一个片段下来
: ，死活连不到另外一个上面去。设计应该没问题。挑菌落小提以后只有带一个片段的载
: 体。我们实验室的技术员最近帮另一个人做分子克隆，也是一样的问题。
:
: Taq
: well
s*a
45 楼
多谢前辈。太专业了，太详细了，太热心了，太感动了！
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
t*n
46 楼
学习收藏了，非常感谢！
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
Taq
well
【在 m*********D 的大作中提到】
: 我是snowyday说的老式酶切连接的老疙瘩了。你这个3KB应该是小菜一碟。上面有人提
: 到的Q5不错。那个GC-melt对付genomic DNA很好，唯一提醒的是primer（match的部分
: ）长一点，我一般25-28nt. 在加GC-melt的情况下，annealing的温度适当比用普通Taq
: 低点，3-5度。
: genomc DNA可以用Qiagen的blood and tissue kit提取.一般12-well plate，一个well
: 就够用20-50次PCR了。
: 我一般把要PCR的fragment在网上扫描一下酶切位点，重点在don't cut和single cut
: list。3kb应该很容易找到合适的位点。然后看自己的vector找合适的酶，加到pcr
: primer的5’end。一般情况下，我会在酶点外再加4 nt,很多酶是不能切直接裸露在5’
: 外的位点的。所以，你的primer该是：4nt-酶点-25ntmatching seq. 3kb,很多情况下
d*i
47 楼
我知道有卖BAC的，拿来可以直接做模板，但是买的BAC名字里不含有某个promoter的名
字，只是一个序号，我不知道怎么确定里面含有我要的promoter。真希望有人给科普一
下。
字，只是一个序号，我不知道怎么确定里面含有我要的promoter。真希望有人给科普一
下。
s*y
48 楼
感觉你连门槛都还没摸着，新来的搬砖伙计吧。做克隆或者说做分子生物还没入门，还
有很长撸要走
【在 d****i 的大作中提到】
: 我知道有卖BAC的，拿来可以直接做模板，但是买的BAC名字里不含有某个promoter的名
: 字，只是一个序号，我不知道怎么确定里面含有我要的promoter。真希望有人给科普一
: 下。
有很长撸要走
【在 d****i 的大作中提到】
: 我知道有卖BAC的，拿来可以直接做模板，但是买的BAC名字里不含有某个promoter的名
: 字，只是一个序号，我不知道怎么确定里面含有我要的promoter。真希望有人给科普一
: 下。
d*i
49 楼
你这么厉害就上来码些没营养的文字？觉得自己什么都是行家都厉害的才是煞笔！你不
愿意回答不愿意帮别人可以绕道啊。
[在 snowyday (北门吹雪) 的大作中提到：]
：感觉你连门槛都还没摸着，新来的搬砖伙计吧。做克隆或者说做分子生物还没入门，
还有很长撸要走
：
：...........
愿意回答不愿意帮别人可以绕道啊。
[在 snowyday (北门吹雪) 的大作中提到：]
：感觉你连门槛都还没摸着，新来的搬砖伙计吧。做克隆或者说做分子生物还没入门，
还有很长撸要走
：
：...........
x*e
50 楼
直接去NCBI blast你的序列啊，搜出来的就有BAC。
【在 d****i 的大作中提到】
: 我知道有卖BAC的，拿来可以直接做模板，但是买的BAC名字里不含有某个promoter的名
: 字，只是一个序号，我不知道怎么确定里面含有我要的promoter。真希望有人给科普一
: 下。
【在 d****i 的大作中提到】
: 我知道有卖BAC的，拿来可以直接做模板，但是买的BAC名字里不含有某个promoter的名
: 字，只是一个序号，我不知道怎么确定里面含有我要的promoter。真希望有人给科普一
: 下。
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