Western蛋白分子量变大很多是什么情况？ - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

Western蛋白分子量变大很多是什么情况？

Western蛋白分子量变大很多是什么情况？# Biology - 生物学

g*n2015-10-19 07:10

1 楼

目标蛋白的分子量应该是80KDa，做了western发现90左右有带，然后250附近也有带，
而且这两条带在null mutant里面都没有，应该是specific的。但为什么会有这么大分
子量的带呢？就算是三聚体的话在变性条件下应该也解聚了吧？
PS: 我用的是Laemmli sample buffer with DTT和SDS，95度5分钟，然后离心之后上样
。用的是NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gel以及NuPAGE MOPS SDS running
buffer。
谢谢大家

s*y2015-10-19 07:10

2 楼

很多常见的modification是可以让蛋白跑得异常的高的。比方说磷酸化或者糖基化。
90左右的带应该是没有修饰过的分子。250的带很可能是磷酸化的分子。如果250的带不
是很sharp而是有拖尾的话，则可能是糖基化。

【在 g*****n 的大作中提到】

: 目标蛋白的分子量应该是80KDa，做了western发现90左右有带，然后250附近也有带，
: 而且这两条带在null mutant里面都没有，应该是specific的。但为什么会有这么大分
: 子量的带呢？就算是三聚体的话在变性条件下应该也解聚了吧？
: PS: 我用的是Laemmli sample buffer with DTT和SDS，95度5分钟，然后离心之后上样
: 。用的是NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gel以及NuPAGE MOPS SDS running
: buffer。
: 谢谢大家

b*y2015-10-19 07:10

3 楼

250 kDa can be trimer. Many proteins can't be completely dissociated on SDS-
PAGE gel.

n*w2015-10-19 07:10

4 楼

有些时候一些蛋白会有oligomeric state, 即使变性，dtt也不会消失。

W*72015-10-19 07:10

5 楼

虽然说mutation里没有，我还是认为用blocking peptide 才能更自信一点说是不是特
异的带。然后再想怎么解释分子量的事。

M*g2015-10-19 07:10

6 楼

Is your protein a membrane protein? Some membrane proteins tend to
aggregate when you boil them in the SDS loading buffer. Try not to boil the
samples and run SDS-PAGE.

i*l2015-10-19 07:10

7 楼

楼上都对，
可能是蛋白有修饰
或者寡聚了
如果怀疑磷酸话，用磷酸酶消化，比较前后变化来证明；怀疑糖基化，就用糖基酶处
理，处理前后跑胶比较。
但是一般糖基化的也不会100%，我做O LinK的糖基化，大多是其中一条本身的带，另一
条大些的糖基划的带；好像磷酸化也是一条本身大小的，一条或几条磷酸化的带，取决
于到底几个磷酸化位点，效率多少。
OLIGOER的问题在高温下，穿膜区有非特异性疏水作用，导致聚合。这时候反而37度变
性更好。
但是，感觉从你描述来看，这个不太像，一般寡居的蛋白会形成Ladder，单体
，二聚，四聚，等等，不只两条带。