western比较一个蛋白含量，上样怎么控制？ - 未名空间MITBBS历史存档

western比较一个蛋白含量，上样怎么控制？# Biology - 生物学

M*92015-10-26 07:10

1 楼

上周一on site，第一个candidate，第二个还没有面。这周HM打电话说是Top
candidate，HR会联系，然后HR联系问搬家费的问题，说让搬家公司和我联系估价，不
知道什么意思？出个Offer真难！

n*e2015-10-26 07:10

2 楼

研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
，总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的，考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
不一样，但总量估计是差不多，符合公司的标量。但是用actin做，正常样品估计只有
肿瘤样品actin的十分之一。问题来了，怎么比较这个蛋白的含量？
很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
做control吗？被接受程度都差不多？
谢谢！

w*r2015-10-26 07:10

3 楼

BCA测测浓度？如果考马斯蓝条带差太多，就是公司浓度不准吧，看到不少paper用考马
斯蓝证明loading接近，不用house keeping

【在 n******e 的大作中提到】

: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ，总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的，考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样，但总量估计是差不多，符合公司的标量。但是用actin做，正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了，怎么比较这个蛋白的含量？
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗？被接受程度都差不多？
: 谢谢！

n*e2015-10-26 07:10

4 楼

怪我没有讲清楚。我是想问，对于用WB半定量比较某个蛋白在正常组织和肿瘤组织的表
达量，一般是用某个house keeping做参照还是控制不同样品的总的蛋白量一致。
多谢你的回答，看来你看文献多是用总蛋白量一致，我看了一些，好多是用actin/
GAPDH之类的做参照。
公司提供的裂解蛋白总蛋白量应该是对的，只是不同分子量的蛋白丰度在正常组织和肿
瘤组织差别很大。所以我发现没有办法用actin做参照，总蛋白量一样的情况下，相差
几乎有十倍。
对于这种临床蛋白样品，是不是很多都是这样的？

【在 w*****r 的大作中提到】

: BCA测测浓度？如果考马斯蓝条带差太多，就是公司浓度不准吧，看到不少paper用考马
: 斯蓝证明loading接近，不用house keeping

x*d2015-10-26 07:10

5 楼

你得考虑ACTA1对你的样品来说是不是一个好的loading control。先换一个control试
试，比如GAPDH

【在 n******e 的大作中提到】

: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ，总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的，考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样，但总量估计是差不多，符合公司的标量。但是用actin做，正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了，怎么比较这个蛋白的含量？
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗？被接受程度都差不多？
: 谢谢！

n*e2015-10-26 07:10

6 楼

研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
，总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的，考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
不一样，但总量估计是差不多，符合公司的标量。但是用actin做，正常样品估计只有
肿瘤样品actin的十分之一。问题来了，怎么比较这个蛋白的含量？
很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
做control吗？被接受程度都差不多？
谢谢！

w*r2015-10-26 07:10

7 楼

BCA测测浓度？如果考马斯蓝条带差太多，就是公司浓度不准吧，看到不少paper用考马
斯蓝证明loading接近，不用house keeping

【在 n******e 的大作中提到】

: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ，总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的，考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样，但总量估计是差不多，符合公司的标量。但是用actin做，正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了，怎么比较这个蛋白的含量？
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗？被接受程度都差不多？
: 谢谢！

n*e2015-10-26 07:10

8 楼

怪我没有讲清楚。我是想问，对于用WB半定量比较某个蛋白在正常组织和肿瘤组织的表
达量，一般是用某个house keeping做参照还是控制不同样品的总的蛋白量一致。
多谢你的回答，看来你看文献多是用总蛋白量一致，我看了一些，好多是用actin/
GAPDH之类的做参照。
公司提供的裂解蛋白总蛋白量应该是对的，只是不同分子量的蛋白丰度在正常组织和肿
瘤组织差别很大。所以我发现没有办法用actin做参照，总蛋白量一样的情况下，相差
几乎有十倍。
对于这种临床蛋白样品，是不是很多都是这样的？

【在 w*****r 的大作中提到】

: BCA测测浓度？如果考马斯蓝条带差太多，就是公司浓度不准吧，看到不少paper用考马
: 斯蓝证明loading接近，不用house keeping

x*d2015-10-26 07:10

9 楼

你得考虑ACTA1对你的样品来说是不是一个好的loading control。先换一个control试
试，比如GAPDH

【在 n******e 的大作中提到】

: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ，总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的，考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样，但总量估计是差不多，符合公司的标量。但是用actin做，正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了，怎么比较这个蛋白的含量？
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗？被接受程度都差不多？
: 谢谢！

l*y2015-10-26 07:10

10 楼

看这篇：
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pmic.200400941/epdf
我刚入行的时候看得是另一篇类似的，但是更细致，给出了不同问题在细胞内不同位置
的蛋白质的好的和差的 loading control，就是现在一时没找到。另外 western 和
pcr 的 control 有时候标准也不一样。

【在 n******e 的大作中提到】

: 研究一个蛋白在正常组织和癌症组织的表达量。找公司买的病人匹配的样品。问题来了
: ，总的上样蛋白量根据公司的浓度是一样的，考马斯染显示两个样品不同条带的浓度都
: 不一样，但总量估计是差不多，符合公司的标量。但是用actin做，正常样品估计只有
: 肿瘤样品actin的十分之一。问题来了，怎么比较这个蛋白的含量？
: 很多文献里都用一个house keeping基因的蛋白做loading control。我可以用蛋白总量
: 做control吗？被接受程度都差不多？
: 谢谢！

b*e2015-10-26 07:10

11 楼

受教！恳请帮忙找一下你说的另一篇paper。

【在 l***y 的大作中提到】

: 看这篇：
: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pmic.200400941/epdf
: 我刚入行的时候看得是另一篇类似的，但是更细致，给出了不同问题在细胞内不同位置
: 的蛋白质的好的和差的 loading control，就是现在一时没找到。另外 western 和
: pcr 的 control 有时候标准也不一样。

C*42015-10-26 07:10

12 楼

可以作WB之前用丽春红染色，肉眼可以大概看的出上样是否均匀，然后计算机扫描然，
用软件做所有条带扫描，得到一个亮度值的和，最后和WB的亮度做个比例。

n*e2015-10-26 07:10

13 楼

谢谢指点。收藏了！
不过现在比较疑惑的问题是，这个比较蛋白在肿瘤和正常组织的表达那种方法合理：
是比较在一样的总蛋白中的表达量，还是通过一些house keeping基因的蛋白作为参照
来上样。
在培养的细胞中，这两种方法可能会比较一致。可在临床组织里，至少在我买到的两组
样品里差异还是很大的。这个在你的这篇文献里也有表现。
主要是样品太贵了，目标蛋白本身含量就少，要再去normalize，太费了。要不就不这
么纠结了。

【在 l***y 的大作中提到】

: 看这篇：
: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/pmic.200400941/epdf
: 我刚入行的时候看得是另一篇类似的，但是更细致，给出了不同问题在细胞内不同位置
: 的蛋白质的好的和差的 loading control，就是现在一时没找到。另外 western 和
: pcr 的 control 有时候标准也不一样。

z*82015-10-26 07:10

14 楼

多试试几个house keep 基因。
每次转膜后Ponceau S staining，拍照。如果house keep基因不行，就用Ponceau S
staining.

【在 n******e 的大作中提到】

: 谢谢指点。收藏了！
: 不过现在比较疑惑的问题是，这个比较蛋白在肿瘤和正常组织的表达那种方法合理：
: 是比较在一样的总蛋白中的表达量，还是通过一些house keeping基因的蛋白作为参照
: 来上样。
: 在培养的细胞中，这两种方法可能会比较一致。可在临床组织里，至少在我买到的两组
: 样品里差异还是很大的。这个在你的这篇文献里也有表现。
: 主要是样品太贵了，目标蛋白本身含量就少，要再去normalize，太费了。要不就不这
: 么纠结了。

n*e2015-10-26 07:10

15 楼

我看也只有这个办法了。多谢了。

【在 z********8 的大作中提到】

:
: 多试试几个house keep 基因。
: 每次转膜后Ponceau S staining，拍照。如果house keep基因不行，就用Ponceau S
: staining.