E*4
2 楼
知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
polyA tail，同样无果。如果实在无解，我们已经考虑要包给公司做了，但是总是要告
诉他们subclone sequence的。希望大神能够指点迷津！跪谢！
lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
. 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
polyA tail，同样无果。如果实在无解，我们已经考虑要包给公司做了，但是总是要告
诉他们subclone sequence的。希望大神能够指点迷津！跪谢！
u*y
3 楼
雪白雪白的一片～
h*y
4 楼
lenti 包装容量有限。你的基因有多大？
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
M*e
5 楼
都好漂亮！
E*4
6 楼
只有1.8kb
【在 h******y 的大作中提到】
: lenti 包装容量有限。你的基因有多大？
:
: sites
【在 h******y 的大作中提到】
: lenti 包装容量有限。你的基因有多大？
:
: sites
z*e
7 楼
俩娃都太美了！
v*e
8 楼
这种情况你只能一一排除，
首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
率不是问题，
第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
蛋白，也可以检测的到
首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
率不是问题，
第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
蛋白，也可以检测的到
s*r
9 楼
越长越像了
【在 M********i 的大作中提到】
: 祝各位巴巴麻麻兔年如意！祝各位宠物宝宝快乐健康！就像小白和哥哥一样:D
【在 M********i 的大作中提到】
: 祝各位巴巴麻麻兔年如意！祝各位宠物宝宝快乐健康！就像小白和哥哥一样:D
E*4
10 楼
我的这个载体就带有GFP，所以看到的结果是，空载体包装病毒没有问题，感染Hela效
率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
谢谢分享经验！
【在 v********e 的大作中提到】
: 这种情况你只能一一排除，
: 首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
: 率不是问题，
: 第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
: 集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
: 次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
: 第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
: 蛋白，也可以检测的到
率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
谢谢分享经验！
【在 v********e 的大作中提到】
: 这种情况你只能一一排除，
: 首先你的lenti假病毒转染Hela的效率，这种试验，可以找携带GFP的假病毒做。如果效
: 率不是问题，
: 第二，你可以拿上清去测P24，检测一下你包的病毒怎么样？或者拿第二次（我一般收
: 集两次，第一次是转染293T后的24小时，第二次是第一次收集后的24小时，然后用第二
: 次收集的做转导）收集的上清去抽提DNA去测你的假病毒有没有包装了你的质粒
: 第三你的flag－tag是不是好用？有些情况下，不好用，除非你已经用这种构建表达过
: 蛋白，也可以检测的到
f*n
11 楼
真干净漂亮
v*e
12 楼
你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白？还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列?
哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
【在 E*********4 的大作中提到】
: 我的这个载体就带有GFP，所以看到的结果是，空载体包装病毒没有问题，感染Hela效
: 率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
: 是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
: 谢谢分享经验！
哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
【在 E*********4 的大作中提到】
: 我的这个载体就带有GFP，所以看到的结果是，空载体包装病毒没有问题，感染Hela效
: 率很高。但是插入我们的基因的病毒感染的Hela就是一片漆黑，完全没有GFP。这是不
: 是说明病毒没有包装我的质粒？关于Flag－tag，在293T里面可以检测到，信号很强。
: 谢谢分享经验！
h*d
13 楼
好看~
F*p
14 楼
把构建好的lentivirus plasmid拿去测序， 可能序列有了问题。
m*u
15 楼
哇，已经这么大了。这孩子是blue point还是seal point的？
Z*5
16 楼
先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
M*i
17 楼
是blue point.脸还没有很黑哈。
谢谢夸奖:)
谢谢夸奖:)
Z*5
18 楼
先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
M*i
19 楼
zz新年好^^.祝你今年拍出更多美片！
【在 z*****e 的大作中提到】
: 俩娃都太美了！
【在 z*****e 的大作中提到】
: 俩娃都太美了！
a*a
20 楼
要看ltr到ltr的总长度。1.8k不小了，如果你的载体里面本来花样就不少，那么插进你
的片段以后可能会超过上限，病毒滴度会降几个数量级
也许你把ires gfp什么都删掉效果会好不少，
【在 E*********4 的大作中提到】
: 只有1.8kb
的片段以后可能会超过上限，病毒滴度会降几个数量级
也许你把ires gfp什么都删掉效果会好不少，
【在 E*********4 的大作中提到】
: 只有1.8kb
M*i
21 楼
小白不好意思地低下了头...左边还有一佗眼s没有擦:P
【在 f*********n 的大作中提到】
: 真干净漂亮
【在 f*********n 的大作中提到】
: 真干净漂亮
p*t
22 楼
请教一下，为什么要用lentivirus？如果只是做过表达细胞系，直接nucleofection然
后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
sites
【在 E*********4 的大作中提到】
: 知道本版的牛人非常多，全部大隐隐于市。希望各位大神能帮忙指出mammalian Hela
: lentivirus expression的问题。我们试图把一个蛋白从pCMV2-N terminal-Flag
: vector上面subclone到另一个lentivirus vector上，然后在Hela里面建立over-
: expression stable cell line。用的是psPAX2 and pMD2G在293T里面包装病毒（在
: 293T里面可以检测到蛋白表达）。问题是empty vector很顺利，但是我们的蛋白没有办
: 法产生病毒，或者说产生的病毒没有办法感染Hela细胞。我尝试过三种不同的
: lentivirus expression vectors，同样的结果。后来怀疑是不是我的蛋白对细胞有毒
: 性，于是又尝试了另外一个安全无害的蛋白，还是同样的结果。现在我怀疑是不是在做
: subcloning的时候，缺了或者多了什么部件？插入的位点是在multiple cloning sites
: . 我的insert只包括N Flag-Protein of interest，没有polyA tail。之前也试过包括
m*u
23 楼
blue point不会变成小黑脸，再加上那么蓝的大眼睛，很美貌啊。我家包子他妈就是
blue point，爸爸是大黑脸的seal point,不过包子自己是seal bi-color,很奇怪的遗
传。
【在 M********i 的大作中提到】
: 是blue point.脸还没有很黑哈。
: 谢谢夸奖:)
blue point，爸爸是大黑脸的seal point,不过包子自己是seal bi-color,很奇怪的遗
传。
【在 M********i 的大作中提到】
: 是blue point.脸还没有很黑哈。
: 谢谢夸奖:)
E*4
24 楼
不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
谢谢！
列?
【在 v********e 的大作中提到】
: 你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白？还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列?
: 哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
谢谢！
列?
【在 v********e 的大作中提到】
: 你是表达GFP目的蛋白的融合蛋白？还是他们之间有某种序列比IRES或者T or P2A序列?
: 哪个在前哪个在后？如果你GFP看不到就要仔细检查下构建策略有没有问题
M*i
25 楼
可能包子爸妈都带了bi-color的隐性基因？小白的麻麻就是blue bi-color。如果
小白没有被KC,她的宝宝也可能是bi-color啵。
【在 m**u 的大作中提到】
: blue point不会变成小黑脸，再加上那么蓝的大眼睛，很美貌啊。我家包子他妈就是
: blue point，爸爸是大黑脸的seal point,不过包子自己是seal bi-color,很奇怪的遗
: 传。
小白没有被KC,她的宝宝也可能是bi-color啵。
【在 m**u 的大作中提到】
: blue point不会变成小黑脸，再加上那么蓝的大眼睛，很美貌啊。我家包子他妈就是
: blue point，爸爸是大黑脸的seal point,不过包子自己是seal bi-color,很奇怪的遗
: 传。
E*4
26 楼
全质粒都要测么？有可能是哪一段出了问题吗？
谢谢！
【在 F******p 的大作中提到】
: 把构建好的lentivirus plasmid拿去测序， 可能序列有了问题。
谢谢！
【在 F******p 的大作中提到】
: 把构建好的lentivirus plasmid拿去测序， 可能序列有了问题。
h*n
27 楼
好漂亮的猫猫啊~~
E*4
28 楼
已经做了，在293T里做transient expression，GFP有很强的信号，蛋白也表达，也有
Flag。
谢谢！
【在 Z******5 的大作中提到】
: 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
Flag。
谢谢！
【在 Z******5 的大作中提到】
: 先把表达蛋白的质粒做个瞬转看看蛋白表达再包病毒比较靠谱。
g*a
29 楼
真美啊。就像两个仙女。。。
E*4
30 楼
想要做成stable cell line，用病毒的话效率会很高。如果直接转染，也可以整合到基
因组，就是效率太低。
【在 p****t 的大作中提到】
: 请教一下，为什么要用lentivirus？如果只是做过表达细胞系，直接nucleofection然
: 后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
:
: sites
因组，就是效率太低。
【在 p****t 的大作中提到】
: 请教一下，为什么要用lentivirus？如果只是做过表达细胞系，直接nucleofection然
: 后再FACS/抗生素筛选不就可以了吗？
:
: sites
s*e
31 楼
thank you 小白和哥哥
v*e
32 楼
这种情况十有八九你包病毒出了问题，建议换一个系统看看，我们通常用的是plenti_
GFP GFP可以用其他基因替换，然后跟pCMV-VSV-G 和pSpAX2包装，从来没遇到过问题，
你可以试试
【在 E*********4 的大作中提到】
: 不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
: 谢谢！
:
: 列?
GFP GFP可以用其他基因替换，然后跟pCMV-VSV-G 和pSpAX2包装，从来没遇到过问题，
你可以试试
【在 E*********4 的大作中提到】
: 不是融合蛋白。蛋白下游有SV40 promoter启动的GFP和Puromycin 标签。
: 谢谢！
:
: 列?
A*R
33 楼
小白也长大了，现在哥哥占了猫树的高处了？蓝眼睛真醉人啊！
M*i
34 楼
lol, 请看高地争夺战
【在 A*********R 的大作中提到】
: 小白也长大了，现在哥哥占了猫树的高处了？蓝眼睛真醉人啊！
【在 A*********R 的大作中提到】
: 小白也长大了，现在哥哥占了猫树的高处了？蓝眼睛真醉人啊！
y*g
35 楼
真漂亮
F*t
36 楼
哈哈
上面那个脸一看就是个男猫哈
虎头虎脑的好俊
上面那个脸一看就是个男猫哈
虎头虎脑的好俊
A*R
37 楼
家中的老大睡得都高一些，小白暂居下风。 俺家还是girl 蜜咪睡得高一些。
j*u
38 楼
太神气啦！
C*r
39 楼
好漂亮的猫猫！
n*e
40 楼
美
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