问一个二硫键形成的实验问题# Biology - 生物学
p*g
1 楼
想把ubiquitin通过C端连接到另外一个protein上。把ubiquitin的C端loop最后一个残
基突变成了Cystein，把目标蛋白表面也突变了一个地方成Cysteine。
都是带His-tag，用镍柱纯化，纯化的时候都用了TCEP。到最后把两个蛋白都换进一个
没有还原剂的buffer，然后dialyse 过夜。结果每次都发现cysteine活性很低，只有少
数的目标蛋白连上了ubiquitin。更不解的是ubiquitin自己应该很容易形成di-
ubiquitin，但这个形成的都不多。
各位前辈有没有过这方面的经验，能不能提供一些建议？多谢多谢
（我想到的是Cysteine已经被提前切掉了。或者被氧化成了非二硫键的氧化产物，比如
sulfinic acid...）
基突变成了Cystein，把目标蛋白表面也突变了一个地方成Cysteine。
都是带His-tag，用镍柱纯化，纯化的时候都用了TCEP。到最后把两个蛋白都换进一个
没有还原剂的buffer，然后dialyse 过夜。结果每次都发现cysteine活性很低，只有少
数的目标蛋白连上了ubiquitin。更不解的是ubiquitin自己应该很容易形成di-
ubiquitin，但这个形成的都不多。
各位前辈有没有过这方面的经验，能不能提供一些建议？多谢多谢
（我想到的是Cysteine已经被提前切掉了。或者被氧化成了非二硫键的氧化产物，比如
sulfinic acid...）
