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求高手指点Cas9 directed Knock-In

求高手指点Cas9 directed Knock-In# Biology - 生物学

e*t2016-06-07 07:06

1 楼

【以下文字转载自 Joke 讨论区】
发信人: kejer (kejer), 信区: Joke
标题: 我家风扇坏了
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Aug 12 11:52:56 2011, 美东)
rt

s*y2016-06-07 07:06

2 楼

如果我们要在哺乳动物细胞做原位knock-in,目前最好用的Cas9是哪个版本的? 我依稀
记得好像说是要用一种比较特殊设计的Cas9以及gRNA?
对于knock-in cassette, 在设计的时候需要注意什么？以及是否能在addgene 上要到
相关的质粒？

c*o2016-06-07 07:06

3 楼

不错，坏得够狠

m*52016-06-07 07:06

4 楼

同问

w*n2016-06-07 07:06

5 楼

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25798939

s*y2016-06-07 07:06

6 楼

呃，看起来很麻烦的样子。

【在 w*****n 的大作中提到】

: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25798939

l*s2016-06-07 07:06

7 楼

没做过，但应该不需要那么麻烦。但肯定比knockout要麻烦，因为需要recombination
。参考如下：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25414344

【在 s******y 的大作中提到】

: 呃，看起来很麻烦的样子。

b*92016-06-07 07:06

8 楼

我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性率大概
在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
我个人觉得要注意以下几点：
1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在同源臂
PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好，做之
前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
5.转染效率，原代一般都比较难转染吧？我们用的是电转。
6.donor载体我直接用的pBluescript SK(+)，转之前线性化处理一下。
7.阳性克隆鉴定有条件的话上southern，没条件用PCR吧，注意在同源臂外面设计引物。
8.再有就是防止细胞污染。

【在 s******y 的大作中提到】

: 如果我们要在哺乳动物细胞做原位knock-in,目前最好用的Cas9是哪个版本的? 我依稀
: 记得好像说是要用一种比较特殊设计的Cas9以及gRNA?
: 对于knock-in cassette, 在设计的时候需要注意什么？以及是否能在addgene 上要到
: 相关的质粒？

s*y2016-06-07 07:06

9 楼

这么说起来，其实要做定点突变的话其实TALEN反而比CRISPR有优势？

【在 b******9 的大作中提到】

: 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性率大概
: 在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127
: 我个人觉得要注意以下几点：
: 1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。
: 2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在同源臂
: PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。
: 3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。
: 4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好，做之
: 前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。
: 5.转染效率，原代一般都比较难转染吧？我们用的是电转。

f*l2016-06-07 07:06

10 楼

看rudolf jaenisch的文章，建议加selection marker，HR arm 别弄得太短，普通cas9
可以用，有些construct可以从addgene买到

【在 s******y 的大作中提到】

s*i2016-06-07 07:06

11 楼

Es cell 的话不要筛选太久、puro 两天就够了，电转后二十四小时开始加药，4天以后
就可以挑克隆了
质粒不用线性化也有很高的效率

: 我做过H9 ESC定点knockin，不过用cas9没成功，用的是TALEN，puro筛选，阳性
率大概

: 在60-70%吧。胖老师可以参考Rudolf的文章：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21738127

: 我个人觉得要注意以下几点：

: 1.在比如293T等比较好转的细胞中做个切割实验：T7EI或者酶切都行。

: 2.如果是用cas9，那donor载体的同源臂需要注意也可能会被cas9切割，最好在
同源臂

: PAM附近做几个同义突变；要是用TALEN就不存在这个问题了。

: 3.donor同源臂至少得有个1kb吧，反正我当时是这样设计的。

: 4.筛选标记：是puromycin还是荧光？如果是抗生素的话建议用puro，效果很好
，做之

: 前得先摸个最佳用药浓度。然后就是筛选时间，H9的话我们筛了2周。

: 5.转染效率，原代一般都比较难转染吧？我们用的是电转。

【在 b******9 的大作中提到】

C*l2016-06-07 07:06

12 楼

这么多细节啊。。。难怪那么多文章很难重复。。
估计作者自己也忘了怎么搞出来了。。

【在 b******9 的大作中提到】

l*y2016-06-07 07:06

13 楼

talen效率更稳定，做过的几个位点都是百分百出克隆，cripsr比较挑位点，成功率没
仔细算过感觉应该不到一半

【在 s******y 的大作中提到】

: 这么说起来，其实要做定点突变的话其实TALEN反而比CRISPR有优势？

s*y2016-06-07 07:06

14 楼

听得我很犹豫。本来我们想用CRISPR 做的，但是听大家这么一说，看来我们还是用
talen做算了。因为反正我们要做的是定点突变，所以off-target 对于我们来讲不是特
别大的问题，因为切错的地方又正好给重组上去的概率应该很低吧？而且反正我们要加
筛选标记的，一开始切的效率高不高并不是一个特别大的考虑。

【在 l***y 的大作中提到】

: talen效率更稳定，做过的几个位点都是百分百出克隆，cripsr比较挑位点，成功率没
: 仔细算过感觉应该不到一半

s*r2016-06-07 07:06

15 楼

选3个gRNA, 在293里试一下效率，选最高的一个就可以啦。CRISPR比TALEN好做多啦

l*y2016-06-07 07:06

16 楼

你lab现在有哪个系统，没有现成talen的还是先用crispr试试看，毕竟简单多了，不行
的话再换好在donor通用的，从头养一套talen系统太麻烦了，花在上面的时间说不定用
crispr克隆都出来了。
off-target谁都说不清楚，其实你要的knockin出来了没人关心怎么来的，反正
reviewer从来不问

听得我很犹豫。本来我们想用CRISPR 做的，但是听大家这么一说，看来我们还是用
talen做算了。因为反正我们要做的是定点突变，所以off-target 对于我们来讲不是特
别大的问题，因为切错的地方又正好给重组上去的概率应该很低吧？而且反正我们要加
筛选标记的，一开始切的效率高不高并不是一个特别大的考虑。

【在 s******y 的大作中提到】

: 听得我很犹豫。本来我们想用CRISPR 做的，但是听大家这么一说，看来我们还是用
: talen做算了。因为反正我们要做的是定点突变，所以off-target 对于我们来讲不是特
: 别大的问题，因为切错的地方又正好给重组上去的概率应该很低吧？而且反正我们要加
: 筛选标记的，一开始切的效率高不高并不是一个特别大的考虑。

s*y2016-06-07 07:06

17 楼

我的实验室里确实哪套系统都没有。如果从头养一套talen系统确实麻烦的话，那么我
还是先用crispr吧。

【在 l***y 的大作中提到】

: 你lab现在有哪个系统，没有现成talen的还是先用crispr试试看，毕竟简单多了，不行
: 的话再换好在donor通用的，从头养一套talen系统太麻烦了，花在上面的时间说不定用
: crispr克隆都出来了。
: off-target谁都说不清楚，其实你要的knockin出来了没人关心怎么来的，反正
: reviewer从来不问
:
: 听得我很犹豫。本来我们想用CRISPR 做的，但是听大家这么一说，看来我们还是用
: talen做算了。因为反正我们要做的是定点突变，所以off-target 对于我们来讲不是特
: 别大的问题，因为切错的地方又正好给重组上去的概率应该很低吧？而且反正我们要加
: 筛选标记的，一开始切的效率高不高并不是一个特别大的考虑。

h*G2016-06-07 07:06

18 楼

只要是mamalian codon optimized的Cas9就可以，最好带GFP or antibiotic
selection，这样可以sort transfected的细胞。
Cas9-2A-GFP/Puro-U6/H1-gRNA的最好。
对于knock-in cassette, 如果你只是single or a few nucleotide mutation, 那么
最方便的应该是直接order single stranded DNA, 长度～ 100 nt. Homology arms >
40 nt 就足够了。
如果是要knockin比较大的insert，比如说GFP reporter，那么可以需要克隆到质粒上,
homology arm > 500 bp，就可以了。可以有antibiotic selection，也可以不用，取
决于你的效率。效率低的情况用antibiotic selection，之后还需要一个step，用cre
-loxp把antibiotic selection cassette给去掉，否则在很多情况下会影响你gene的表
达。
在两种情况都要注意， Cas9/gRNA不能cut repair donor，否则你knockin了，Cas9/
gRNA继续cut，就不好了。
最常用的方法是introduce silent mutation。

【在 s******y 的大作中提到】

m*o2016-06-07 07:06

19 楼

mark

m*e2016-06-07 07:06

20 楼

1 韩的方法最为简洁，方便。
2 他文章里用的cas9作为knockin的control，那个protocol也很clean。完全不用donor
plasmid，直接合成flag/GFP containing gBlock，加上CAS9+gRNA， antibiotics筛
即可。

p*82016-06-07 07:06

21 楼

Which vector did you use in the human Es cells ?