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如何在hESC里过表达基因

如何在hESC里过表达基因# Biology - 生物学

z*n2016-10-12 07:10

1 楼

总结了下买有子西瓜和无籽西瓜的经验
还是更喜欢有子西瓜
有子西瓜一般更沙更甜，而且个头也更大
而无籽西瓜则没有有子西瓜的这些优点
吃起来板板的
当然也许有的人喜欢这种，我就不是很喜欢

C*y2016-10-12 07:10

2 楼

4s被女友拿刀背敲碎了。sprint的计划还有一年多。不想花个五六百买个新手机。怎么
办。用翻盖手机？

B*y2016-10-12 07:10

3 楼

最近我需要在human ESC里过表达gene of interest。我用的是pCDH vector，然后做
virus transduction，接着把细胞养在含有puro 的media里。开始还有不少colonies存
活，并且还是RFP positive（我用的pCDH是带RFP的）。养了大概3－4代后，colonies
的数量开始越来越少。我和朋友讨论，据说是因为transgene容易被silenced？总共有3
个independent lines都出现类似的情况。大家对这个怎么看？有什么好的建议吗？非
常感谢！

G*a2016-10-12 07:10

4 楼

要是有籽西瓜的口感但是无籽西瓜的方便加到一起该多好！我就是不喜欢无籽西瓜，但
吐籽太麻烦，所以就不吃西瓜。

【在 z******n 的大作中提到】

: 总结了下买有子西瓜和无籽西瓜的经验
: 还是更喜欢有子西瓜
: 有子西瓜一般更沙更甜，而且个头也更大
: 而无籽西瓜则没有有子西瓜的这些优点
: 吃起来板板的
: 当然也许有的人喜欢这种，我就不是很喜欢

g*12016-10-12 07:10

5 楼

修？

【在 C****y 的大作中提到】

: 4s被女友拿刀背敲碎了。sprint的计划还有一年多。不想花个五六百买个新手机。怎么
: 办。用翻盖手机？

s*i2016-10-12 07:10

6 楼

pMSCV retroviruses

f*c2016-10-12 07:10

7 楼

直接打成汁喝，就没此烦恼了。嚇嚇

【在 G********a 的大作中提到】

: 要是有籽西瓜的口感但是无籽西瓜的方便加到一起该多好！我就是不喜欢无籽西瓜，但
: 吐籽太麻烦，所以就不吃西瓜。

p*92016-10-12 07:10

8 楼

对女友干啥了？

【在 C****y 的大作中提到】

: 4s被女友拿刀背敲碎了。sprint的计划还有一年多。不想花个五六百买个新手机。怎么
: 办。用翻盖手机？

l*y2016-10-12 07:10

9 楼

promoter用EF1a别用CMV系列，lenti表达个RFP十代没问题。silencing没办法就是快点
慢点，gene有功能的影响细胞会丢得更快，隔几代用puro重筛一下

colonies
有3

【在 B*******y 的大作中提到】

: 最近我需要在human ESC里过表达gene of interest。我用的是pCDH vector，然后做
: virus transduction，接着把细胞养在含有puro 的media里。开始还有不少colonies存
: 活，并且还是RFP positive（我用的pCDH是带RFP的）。养了大概3－4代后，colonies
: 的数量开始越来越少。我和朋友讨论，据说是因为transgene容易被silenced？总共有3
: 个independent lines都出现类似的情况。大家对这个怎么看？有什么好的建议吗？非
: 常感谢！

G*a2016-10-12 07:10

10 楼

那更麻烦！还得刷果汁机，算了。

【在 f*****c 的大作中提到】

: 直接打成汁喝，就没此烦恼了。嚇嚇

C*y2016-10-12 07:10

11 楼

修。。没有insurance. 屏幕和背面全部碎了。连里面的板都裂了。

B*y2016-10-12 07:10

12 楼

非常感谢！我好好读下pMSCV retroviruses的manual。你觉得用pCDH是因为这些
transgene被silenced吗？还是有其他的原因？非常非常感谢！

【在 s*****i 的大作中提到】

: pMSCV retroviruses

z*n2016-10-12 07:10

13 楼

呵呵，我也不喜欢刷果汁机，尤其是怕哪个刀片会
不小心割到哪里

【在 G********a 的大作中提到】

: 那更麻烦！还得刷果汁机，算了。

C*y2016-10-12 07:10

14 楼

闹矛盾。把我手机拿去往墙上砸，没事，拿刀背砸。。

【在 p******9 的大作中提到】

: 对女友干啥了？

f*e2016-10-12 07:10

15 楼

不要用mscv，cmv这些常规retrovirus的promoter，很快会被silence，可以用plenti，
psin，phage等，ef1a, cag, pgk可以坚持一段时间，但是也存在被silence等现象.转
质粒总体比较困难，病毒是最高效的方法。在细胞传代的同时加lentivirus，
polybrene，然后spin半小时，效率会很高. rock inhibitor记得加，不然细胞会死光
光.病毒含血清的话几个小时后就可以换掉，如果要drug selection，过夜也没事，第
二天可以继续加rock inhibitor，浓度可以降到5um。
good luck！

: 非常感谢！我好好读下pMSCV retroviruses的manual。你觉得用pCDH是因为这些

: transgene被silenced吗？还是有其他的原因？非常非常感谢！

【在 B*******y 的大作中提到】

: 非常感谢！我好好读下pMSCV retroviruses的manual。你觉得用pCDH是因为这些
: transgene被silenced吗？还是有其他的原因？非常非常感谢！

j*p2016-10-12 07:10

16 楼

我现在觉得无籽的好吃还方便。适合有娃家庭

p*92016-10-12 07:10

17 楼

太暴力了。。。下次回国弄几个山寨iphone给她砸。。。

【在 C****y 的大作中提到】

: 闹矛盾。把我手机拿去往墙上砸，没事，拿刀背砸。。

j*o2016-10-12 07:10

18 楼

试试UCOE promoter
Silent IL2RG Gene Editing in Human Pluripotent Stem Cells.
“ Here, we show that a major limitation in isolating edited clones is
silencing of the selectable marker cassette after homologous recombination
and that this can be overcome by using a ubiquitous chromatin opening
element (UCOE) promoter-driven transgene. ”

colonies
有3

【在 B*******y 的大作中提到】

n*d2016-10-12 07:10

19 楼

自己种的有籽西瓜想不是沙瓤都难啊. 不过costco我也能挑到沙瓤的无籽瓜

I*92016-10-12 07:10

20 楼

买个二手的 ip4 200刀差不多

B*y2016-10-12 07:10

21 楼

非常感谢。我用的pCDH是EF1a promoter，就是越往后传代，colonies数量越少。我把
细胞一直养在含puro的hESC media里。非常感谢你的帮助。

【在 l***y 的大作中提到】

: promoter用EF1a别用CMV系列，lenti表达个RFP十代没问题。silencing没办法就是快点
: 慢点，gene有功能的影响细胞会丢得更快，隔几代用puro重筛一下
:
: colonies
: 有3

y*82016-10-12 07:10

22 楼

口笨的居然没有觉得有籽vs无籽有什么区别也，只要是个西瓜都爱吃似乎我们这里基
本卖的都是无籽瓜。

z*n2016-10-12 07:10

23 楼

WK, 我第一次看见4s还能上网自动发贴...而且是被刀背砸过后.

【在 C****y 的大作中提到】

: 闹矛盾。把我手机拿去往墙上砸，没事，拿刀背砸。。

B*y2016-10-12 07:10

24 楼

非常感谢这么detailed的建议。我们系的一个PI给我建议了一个他自己改造的plasmid
，他说这个plasmid 包含 insulator，用的是Ubi promoter，同时带GFP-IRES-puro。
我先试试这个plasmid，看看能不能挺住不被silenced。非常感谢你的帮助，我自己没
有做过virus transduction，都是我们实验室的technician帮我做的。我把你的建议和
他讨论讨论，因为我觉得我们virus transduction的效率不是特别高。

【在 f*******e 的大作中提到】

: 不要用mscv，cmv这些常规retrovirus的promoter，很快会被silence，可以用plenti，
: psin，phage等，ef1a, cag, pgk可以坚持一段时间，但是也存在被silence等现象.转
: 质粒总体比较困难，病毒是最高效的方法。在细胞传代的同时加lentivirus，
: polybrene，然后spin半小时，效率会很高. rock inhibitor记得加，不然细胞会死光
: 光.病毒含血清的话几个小时后就可以换掉，如果要drug selection，过夜也没事，第
: 二天可以继续加rock inhibitor，浓度可以降到5um。
: good luck！
:
:
: 非常感谢！我好好读下pMSCV retroviruses的manual。你觉得用pCDH是因为这些
:
: transgene被silenced吗？还是有其他的原因？非常非常感谢！

a*u2016-10-12 07:10

25 楼

更喜欢有子瓜的味道，但是无子瓜也喜欢，总之是西瓜就喜欢

【在 z******n 的大作中提到】

v*e2016-10-12 07:10

26 楼

反了他了

【在 C****y 的大作中提到】

: 闹矛盾。把我手机拿去往墙上砸，没事，拿刀背砸。。

B*y2016-10-12 07:10

27 楼

非常感谢。Interesting，我好好读下这个UCOE。

【在 j******o 的大作中提到】

: 试试UCOE promoter
: Silent IL2RG Gene Editing in Human Pluripotent Stem Cells.
: “ Here, we show that a major limitation in isolating edited clones is
: silencing of the selectable marker cassette after homologous recombination
: and that this can be overcome by using a ubiquitous chromatin opening
: element (UCOE) promoter-driven transgene. ”
:
: colonies
: 有3

s*02016-10-12 07:10

28 楼

好像是local的店都是无籽店多，买有籽的我一般我沃尔玛买，都是很长的那种

【在 y*****8 的大作中提到】

: 口笨的居然没有觉得有籽vs无籽有什么区别也，只要是个西瓜都爱吃似乎我们这里基
: 本卖的都是无籽瓜。

C*y2016-10-12 07:10

29 楼

哈哈我修改了。现在大家肯定看的一头污水

【在 z*n 的大作中提到】

: WK, 我第一次看见4s还能上网自动发贴...而且是被刀背砸过后.

s*r2016-10-12 07:10

30 楼

建议用PB transposon做，比virus方便多了

m*g2016-10-12 07:10

31 楼

同感同感！只是无籽瓜不好买到。把无籽瓜的籽种下几粒，不知道是否可以长出西瓜来？
在 ziluolan (桔梗) 的大作中提到: 】

r*82016-10-12 07:10

32 楼

太火爆了，换女友吧

【在 C****y 的大作中提到】

: 闹矛盾。把我手机拿去往墙上砸，没事，拿刀背砸。。

m*g2016-10-12 07:10

33 楼

很羡慕你，瓜种得真好。无籽瓜的籽可以种出西瓜吗？我指的是吃瓜吐出来的籽（不
是买的种子）。

【在 n*******d 的大作中提到】

: 自己种的有籽西瓜想不是沙瓤都难啊. 不过costco我也能挑到沙瓤的无籽瓜

n*y2016-10-12 07:10

34 楼

今天会用刀背砸手机
明天就会用刀刃砍你
楼主你看着办吧

【在 C****y 的大作中提到】

: 闹矛盾。把我手机拿去往墙上砸，没事，拿刀背砸。。

n*d2016-10-12 07:10

35 楼

无籽瓜偶尔有籽, 但不能当种子. 这个比一般的杂交还复杂, 涉及到什么二倍体/四倍
体之类的东东.

【在 m*********g 的大作中提到】

: 很羡慕你，瓜种得真好。无籽瓜的籽可以种出西瓜吗？我指的是吃瓜吐出来的籽（不
: 是买的种子）。

a*m2016-10-12 07:10

36 楼

不会的。那是后天。。。。明天是用刀背砍。。。

【在 n**y 的大作中提到】

: 今天会用刀背砸手机
: 明天就会用刀刃砍你
: 楼主你看着办吧

m*g2016-10-12 07:10

37 楼

太感谢牛人北木！其实我想问的是有籽瓜的籽可以种出瓜来吗？结果问反了。能再给答
案吗？实在感谢！

【在 n*******d 的大作中提到】

: 无籽瓜偶尔有籽, 但不能当种子. 这个比一般的杂交还复杂, 涉及到什么二倍体/四倍
: 体之类的东东.

p*92016-10-12 07:10

38 楼

果黑都有暴力倾向嘛？

【在 r*****8 的大作中提到】

: 太火爆了，换女友吧

z*n2016-10-12 07:10

39 楼

可以的啊

【在 m*********g 的大作中提到】

: 太感谢牛人北木！其实我想问的是有籽瓜的籽可以种出瓜来吗？结果问反了。能再给答
: 案吗？实在感谢！

r*82016-10-12 07:10

40 楼

这跟果黑没有关系吧，即使LZ 拿个安卓机，恐怕也被砸了, 那么可以推论她是果粉了?

【在 p******9 的大作中提到】

: 果黑都有暴力倾向嘛？

M*s2016-10-12 07:10

41 楼

无

s*h2016-10-12 07:10

42 楼

起诉女友损害个人财产。

c*r2016-10-12 07:10

43 楼

还以为你女友砸了汽车4S专卖店，LOL

【在 C****y 的大作中提到】

: 4s被女友拿刀背敲碎了。sprint的计划还有一年多。不想花个五六百买个新手机。怎么
: 办。用翻盖手机？

j*z2016-10-12 07:10

44 楼

去ebay上买个二手的就好了，iphone比较贵，可以看看S2、S3或者HTC

【在 C****y 的大作中提到】

: 4s被女友拿刀背敲碎了。sprint的计划还有一年多。不想花个五六百买个新手机。怎么
: 办。用翻盖手机？

a*m2016-10-12 07:10

45 楼

不要和果轮谈逻辑。

了?

【在 r*****8 的大作中提到】

: 这跟果黑没有关系吧，即使LZ 拿个安卓机，恐怕也被砸了, 那么可以推论她是果粉了?

b*z2016-10-12 07:10

46 楼

扬刀立威，这就是小老婆的下场。多疼老婆少玩机

b*22016-10-12 07:10

47 楼

太火爆了。。。

z*52016-10-12 07:10

48 楼

最便宜的？买verizon bad esn刷。

l*m2016-10-12 07:10

49 楼

换安卓机，砸墙直接就碎了，不会动刀子了

了?

【在 r*****8 的大作中提到】

: 这跟果黑没有关系吧，即使LZ 拿个安卓机，恐怕也被砸了, 那么可以推论她是果粉了?

r*82016-10-12 07:10

50 楼

安卓机是塑料的, 哪有那么容易碎?

【在 l*m 的大作中提到】

: 换安卓机，砸墙直接就碎了，不会动刀子了
:
: 了?

K*a2016-10-12 07:10

51 楼

这叫假死。。。后盖，电池散一地，之后再装回去继续用

【在 r*****8 的大作中提到】

: 安卓机是塑料的, 哪有那么容易碎?

p*92016-10-12 07:10

52 楼

就怕主板啥的也散了一地

【在 K*******a 的大作中提到】

: 这叫假死。。。后盖，电池散一地，之后再装回去继续用

C*y2016-10-12 07:10

53 楼

决定找出旧的黑莓用几个月，然后renew.

C*y2016-10-12 07:10

54 楼

决定找出旧的黑莓，然后用几个月