o*2
2 楼
我们能不能电话那些机票代理，问能不能买到那些单程从中国来美国的机票？
O*e
3 楼
PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
谢谢。
仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
谢谢。
C*R
4 楼
http://dx.doi.org/10.1016/B978-008044163-4/50015-2
Chapter 15 -
Electron Energy-Loss Spectroscopy and its Applications to Characterization
of Carbon Materials
Hisako Hirai
Carbon Alloys
Novel Concepts to Develop Carbon Science and Technology
2003, Pages 239-256
请发
h**[email protected]
Chapter 15 -
Electron Energy-Loss Spectroscopy and its Applications to Characterization
of Carbon Materials
Hisako Hirai
Carbon Alloys
Novel Concepts to Develop Carbon Science and Technology
2003, Pages 239-256
请发
h**[email protected]
b*x
5 楼
looks nice.
Guess it will be better if you add some thing red:)
Guess it will be better if you add some thing red:)
t*s
6 楼
iflychina.net找代理。
单程的和往返价格有时差不多。
单程的和往返价格有时差不多。
I*a
7 楼
换载体试试？
c*A
9 楼
好像不能加红色，这道菜还有个名字叫金玉满堂。
O*e
10 楼
试过了。加到了原文。
【在 I***a 的大作中提到】
: 换载体试试？
【在 I***a 的大作中提到】
: 换载体试试？
C*R
11 楼
thanks
【在 R*******d 的大作中提到】
: http://www.megaupload.com/?d=8DUC1TQ6
【在 R*******d 的大作中提到】
: http://www.megaupload.com/?d=8DUC1TQ6
t*g
12 楼
松仁玉米可以加红辣椒的，金玉满堂好像还要加青豆啥的
【在 c*******A 的大作中提到】
: 好像不能加红色，这道菜还有个名字叫金玉满堂。
【在 c*******A 的大作中提到】
: 好像不能加红色，这道菜还有个名字叫金玉满堂。
a*e
13 楼
screen more
i*s
14 楼
我以前在饭馆吃过的松仁玉米都是只有松仁和玉米的啊
【在 c*******A 的大作中提到】
: 好像不能加红色，这道菜还有个名字叫金玉满堂。
【在 c*******A 的大作中提到】
: 好像不能加红色，这道菜还有个名字叫金玉满堂。
a*e
15 楼
and how about Gateway system?
t*a
16 楼
我也是。松仁玉米我在家经常做，玉米就是买costco那种罐头的，既简单又好吃。
这个放了青椒的看着有点奇怪
【在 i***s 的大作中提到】
: 我以前在饭馆吃过的松仁玉米都是只有松仁和玉米的啊
这个放了青椒的看着有点奇怪
【在 i***s 的大作中提到】
: 我以前在饭馆吃过的松仁玉米都是只有松仁和玉米的啊
I*a
17 楼
TA, blunt,
可能容量有点小？
可能容量有点小？
s*e
18 楼
加豌豆比较好，味道比较配，颜色也更好看。青椒会出水，松仁就不脆了
松仁是不是有点炒过了
【在 t*****g 的大作中提到】
: 松仁有点贵
松仁是不是有点炒过了
【在 t*****g 的大作中提到】
: 松仁有点贵
l*1
19 楼
有时DNA有二级结构或者重复之类容易发生重组。试一试SURE competent cells：
http://www.stratagene.com/products/displayproduct.aspx?pid=290
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
http://www.stratagene.com/products/displayproduct.aspx?pid=290
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
r*g
20 楼
我在南方吃的貌似都是松仁玉米；北方的还加胡萝卜青椒什么的。不过都还挺好吃的～
【在 i***s 的大作中提到】
: 我以前在饭馆吃过的松仁玉米都是只有松仁和玉米的啊
【在 i***s 的大作中提到】
: 我以前在饭馆吃过的松仁玉米都是只有松仁和玉米的啊
N*o
21 楼
try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
other) while cloning and finally ligate the two. good luck!
Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
other) while cloning and finally ligate the two. good luck!
s*0
22 楼
不用加淀粉？
y*i
23 楼
1. 改温度，30度摇菌, 放plate
2. 象你做的，改质粒和细菌。
3. 挑colony时，不但挑大的，也挑些小colony。plasmid有毒性的话，阳性clony 长
得慢。plate 放时间长些，让小colony长大。
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
2. 象你做的，改质粒和细菌。
3. 挑colony时，不但挑大的，也挑些小colony。plasmid有毒性的话，阳性clony 长
得慢。plate 放时间长些，让小colony长大。
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
O*e
24 楼
stb12? from which company? A simple search brought it to stratagene,but
nothing on their website. Thanks.
).
【在 N*o 的大作中提到】
: try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
: Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
: other) while cloning and finally ligate the two. good luck!
nothing on their website. Thanks.
).
【在 N*o 的大作中提到】
: try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
: Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
: other) while cloning and finally ligate the two. good luck!
t*r
25 楼
stb12 is a piece of garbage
).
【在 N*o 的大作中提到】
: try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
: Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
: other) while cloning and finally ligate the two. good luck!
).
【在 N*o 的大作中提到】
: try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
: Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
: other) while cloning and finally ligate the two. good luck!
N*o
26 楼
worked for my clone!
【在 t******r 的大作中提到】
: stb12 is a piece of garbage
:
: ).
X*n
27 楼
哪一段？可以的话说出来看看。
我也在克隆3‘-UTR，大片段阳性克隆数是比较低，也有你这样的情况。
好在最后都出来了，好像没有不稳定。
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
我也在克隆3‘-UTR，大片段阳性克隆数是比较低，也有你这样的情况。
好在最后都出来了，好像没有不稳定。
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
N*o
28 楼
just realised it's actually "Stbl2". invitrogen. give it a try maybe?
btw, keeping the insert in two separate plasmids usually helps if ur
sequence has instability problem or is toxic to the bacteria
【在 O******e 的大作中提到】
: stb12? from which company? A simple search brought it to stratagene,but
: nothing on their website. Thanks.
:
: ).
t*p
29 楼
这个现象我以前碰到过，丢失的序列是TA rich，或者重复序列。最后解决的办法是降
低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
stellar，还有promega的。
【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA，试图克隆进载体。阳性克隆数很低（or 大量假阳性），而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆，经过酶切或两端测序，发现或者中间缺失，或
: 者一端缺失，长度在2－3k之间，克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月，请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA，也许克隆后不稳
: 定？是重组吗？试过几种载体（TA或Blunt）和E.coli，包括Top10，clontech的stellar，还有promega的。
: 谢谢。
O*e
30 楼
是什么菌？还是不管啥strain都可以在<=30度试试？谢。
我的也是有很多重复序列。
【在 t****p 的大作中提到】
: 这个现象我以前碰到过，丢失的序列是TA rich，或者重复序列。最后解决的办法是降
: 低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
:
: stellar，还有promega的。
我的也是有很多重复序列。
【在 t****p 的大作中提到】
: 这个现象我以前碰到过，丢失的序列是TA rich，或者重复序列。最后解决的办法是降
: 低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
:
: stellar，还有promega的。
t*p
31 楼
top10
其它菌只要是用于抽质粒用的，应该都一样吧。
【在 O******e 的大作中提到】
: 是什么菌？还是不管啥strain都可以在<=30度试试？谢。
: 我的也是有很多重复序列。
其它菌只要是用于抽质粒用的，应该都一样吧。
【在 O******e 的大作中提到】
: 是什么菌？还是不管啥strain都可以在<=30度试试？谢。
: 我的也是有很多重复序列。
n*k
32 楼
have u tried recommendation incompetent cells, never done it myself but I
thought those have been
developed for cloning of this kind...shall be RecA/BCD all minus...
【在 t****p 的大作中提到】
: 这个现象我以前碰到过，丢失的序列是TA rich，或者重复序列。最后解决的办法是降
: 低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
:
: stellar，还有promega的。
thought those have been
developed for cloning of this kind...shall be RecA/BCD all minus...
【在 t****p 的大作中提到】
: 这个现象我以前碰到过，丢失的序列是TA rich，或者重复序列。最后解决的办法是降
: 低菌的生长浓度，包括转化以后和摇菌，都用30度以下的温度。
:
: stellar，还有promega的。
O*e
33 楼
Any suggestions other than Sure cells?
Thanks.
【在 n********k 的大作中提到】
: have u tried recommendation incompetent cells, never done it myself but I
: thought those have been
: developed for cloning of this kind...shall be RecA/BCD all minus...
Thanks.
【在 n********k 的大作中提到】
: have u tried recommendation incompetent cells, never done it myself but I
: thought those have been
: developed for cloning of this kind...shall be RecA/BCD all minus...
a*s
34 楼
这种情况我以前也遇到过，后来发现把转化时42度热击的时间从30秒延长到45-50秒就
基本解决了。大片段的插入片段在热击时如果时间不够长的话，就会发生missing部分
片段的情况，推测可能是部分末端的DNA来不及进入E.coli。
BTW：你是不是在用TOPO载体？TOPO对于3kb以下的插入片段好像还稳定，大于3kb的片
段就经常出问题，至少在我手上。我后来换了Promega的T-vector就一直很稳定。
基本解决了。大片段的插入片段在热击时如果时间不够长的话，就会发生missing部分
片段的情况，推测可能是部分末端的DNA来不及进入E.coli。
BTW：你是不是在用TOPO载体？TOPO对于3kb以下的插入片段好像还稳定，大于3kb的片
段就经常出问题，至少在我手上。我后来换了Promega的T-vector就一直很稳定。
O*e
35 楼
两种都用过。大片段延长Heat Shock时间不知啥原理，有人有类似经验吗？
还有个实际问题就是，ligation反应之后放-20度，多久之后仍然可以用来做转化？感
觉如果ligate了，应该很稳定吧。大多数manual说可以overnight，有高手放了几天或
更久之后仍然成功转化的吗？我没试过，纯经验请教。
谢谢。
【在 a**********s 的大作中提到】
: 这种情况我以前也遇到过，后来发现把转化时42度热击的时间从30秒延长到45-50秒就
: 基本解决了。大片段的插入片段在热击时如果时间不够长的话，就会发生missing部分
: 片段的情况，推测可能是部分末端的DNA来不及进入E.coli。
: BTW：你是不是在用TOPO载体？TOPO对于3kb以下的插入片段好像还稳定，大于3kb的片
: 段就经常出问题，至少在我手上。我后来换了Promega的T-vector就一直很稳定。
还有个实际问题就是，ligation反应之后放-20度，多久之后仍然可以用来做转化？感
觉如果ligate了，应该很稳定吧。大多数manual说可以overnight，有高手放了几天或
更久之后仍然成功转化的吗？我没试过，纯经验请教。
谢谢。
【在 a**********s 的大作中提到】
: 这种情况我以前也遇到过，后来发现把转化时42度热击的时间从30秒延长到45-50秒就
: 基本解决了。大片段的插入片段在热击时如果时间不够长的话，就会发生missing部分
: 片段的情况，推测可能是部分末端的DNA来不及进入E.coli。
: BTW：你是不是在用TOPO载体？TOPO对于3kb以下的插入片段好像还稳定，大于3kb的片
: 段就经常出问题，至少在我手上。我后来换了Promega的T-vector就一直很稳定。
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