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o*2
2
我们能不能电话那些机票代理,问能不能买到那些单程从中国来美国的机票?
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O*e
3
PCR出一段5k genomic DNA,试图克隆进载体。阳性克隆数很低(or 大量假阳性),而
仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆,经过酶切或两端测序,发现或者中间缺失,或
者一端缺失,长度在2-3k之间,克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
insert完整。已困扰3月,请高手解释原因和解决办法。
这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA,也许克隆后不稳
定?是重组吗?试过几种载体(TA或Blunt)和E.coli,包括Top10,clontech的stellar,还有promega的。
谢谢。
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b*x
5
looks nice.
Guess it will be better if you add some thing red:)
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t*s
6
iflychina.net找代理。
单程的和往返价格有时差不多。
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I*a
7
换载体试试?
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c*A
9
好像不能加红色,这道菜还有个名字叫金玉满堂。
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O*e
10
试过了。加到了原文。

【在 I***a 的大作中提到】
: 换载体试试?
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t*g
12
松仁玉米可以加红辣椒的,金玉满堂好像还要加青豆啥的

【在 c*******A 的大作中提到】
: 好像不能加红色,这道菜还有个名字叫金玉满堂。
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a*e
13
screen more
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i*s
14
我以前在饭馆吃过的松仁玉米都是只有松仁和玉米的啊

【在 c*******A 的大作中提到】
: 好像不能加红色,这道菜还有个名字叫金玉满堂。
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a*e
15
and how about Gateway system?
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t*a
16
我也是。松仁玉米我在家经常做,玉米就是买costco那种罐头的,既简单又好吃。
这个放了青椒的看着有点奇怪

【在 i***s 的大作中提到】
: 我以前在饭馆吃过的松仁玉米都是只有松仁和玉米的啊
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I*a
17
TA, blunt,
可能容量有点小?
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s*e
18
加豌豆比较好,味道比较配,颜色也更好看。青椒会出水,松仁就不脆了
松仁是不是有点炒过了

【在 t*****g 的大作中提到】
: 松仁有点贵
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l*1
19
有时DNA有二级结构或者重复之类容易发生重组。试一试SURE competent cells:
http://www.stratagene.com/products/displayproduct.aspx?pid=290

stellar,还有promega的。

【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA,试图克隆进载体。阳性克隆数很低(or 大量假阳性),而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆,经过酶切或两端测序,发现或者中间缺失,或
: 者一端缺失,长度在2-3k之间,克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月,请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA,也许克隆后不稳
: 定?是重组吗?试过几种载体(TA或Blunt)和E.coli,包括Top10,clontech的stellar,还有promega的。
: 谢谢。

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r*g
20
我在南方吃的貌似都是松仁玉米;北方的还加胡萝卜青椒什么的。不过都还挺好吃的~

【在 i***s 的大作中提到】
: 我以前在饭馆吃过的松仁玉米都是只有松仁和玉米的啊
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N*o
21
try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
other) while cloning and finally ligate the two. good luck!
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s*0
22
不用加淀粉?
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y*i
23
1. 改温度,30度摇菌, 放plate
2. 象你做的,改质粒和细菌。
3. 挑colony时,不但挑大的,也挑些小colony。plasmid有毒性的话,阳性clony 长
得慢。plate 放时间长些,让小colony长大。

stellar,还有promega的。

【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA,试图克隆进载体。阳性克隆数很低(or 大量假阳性),而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆,经过酶切或两端测序,发现或者中间缺失,或
: 者一端缺失,长度在2-3k之间,克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月,请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA,也许克隆后不稳
: 定?是重组吗?试过几种载体(TA或Blunt)和E.coli,包括Top10,clontech的stellar,还有promega的。
: 谢谢。

avatar
O*e
24
stb12? from which company? A simple search brought it to stratagene,but
nothing on their website. Thanks.

).

【在 N*o 的大作中提到】
: try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
: Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
: other) while cloning and finally ligate the two. good luck!

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t*r
25
stb12 is a piece of garbage

).

【在 N*o 的大作中提到】
: try stb12 bacteria (grown at 30C); try promoter-less plasmid (pUC18, pUC19).
: Or try keeping the insert in two plasmids (e.g. 2kb in one, 3kb in the
: other) while cloning and finally ligate the two. good luck!

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N*o
26

worked for my clone!

【在 t******r 的大作中提到】
: stb12 is a piece of garbage
:
: ).

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X*n
27
哪一段?可以的话说出来看看。
我也在克隆3‘-UTR,大片段阳性克隆数是比较低,也有你这样的情况。
好在最后都出来了,好像没有不稳定。

stellar,还有promega的。

【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA,试图克隆进载体。阳性克隆数很低(or 大量假阳性),而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆,经过酶切或两端测序,发现或者中间缺失,或
: 者一端缺失,长度在2-3k之间,克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月,请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA,也许克隆后不稳
: 定?是重组吗?试过几种载体(TA或Blunt)和E.coli,包括Top10,clontech的stellar,还有promega的。
: 谢谢。

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N*o
28

just realised it's actually "Stbl2". invitrogen. give it a try maybe?
btw, keeping the insert in two separate plasmids usually helps if ur
sequence has instability problem or is toxic to the bacteria

【在 O******e 的大作中提到】
: stb12? from which company? A simple search brought it to stratagene,but
: nothing on their website. Thanks.
:
: ).

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t*p
29
这个现象我以前碰到过,丢失的序列是TA rich,或者重复序列。最后解决的办法是降
低菌的生长浓度,包括转化以后和摇菌,都用30度以下的温度。

stellar,还有promega的。

【在 O******e 的大作中提到】
: PCR出一段5k genomic DNA,试图克隆进载体。阳性克隆数很低(or 大量假阳性),而
: 仅有的几个通过clony pcr筛选的克隆,经过酶切或两端测序,发现或者中间缺失,或
: 者一端缺失,长度在2-3k之间,克隆进去的片段序列正确。Ligation前跑胶确认PCR
: insert完整。已困扰3月,请高手解释原因和解决办法。
: 这段序列含一个基因的3' UTR及之后的大量non-coding genomic DNA,也许克隆后不稳
: 定?是重组吗?试过几种载体(TA或Blunt)和E.coli,包括Top10,clontech的stellar,还有promega的。
: 谢谢。

avatar
O*e
30
是什么菌?还是不管啥strain都可以在<=30度试试?谢。
我的也是有很多重复序列。

【在 t****p 的大作中提到】
: 这个现象我以前碰到过,丢失的序列是TA rich,或者重复序列。最后解决的办法是降
: 低菌的生长浓度,包括转化以后和摇菌,都用30度以下的温度。
:
: stellar,还有promega的。

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t*p
31
top10
其它菌只要是用于抽质粒用的,应该都一样吧。

【在 O******e 的大作中提到】
: 是什么菌?还是不管啥strain都可以在<=30度试试?谢。
: 我的也是有很多重复序列。

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n*k
32
have u tried recommendation incompetent cells, never done it myself but I
thought those have been
developed for cloning of this kind...shall be RecA/BCD all minus...

【在 t****p 的大作中提到】
: 这个现象我以前碰到过,丢失的序列是TA rich,或者重复序列。最后解决的办法是降
: 低菌的生长浓度,包括转化以后和摇菌,都用30度以下的温度。
:
: stellar,还有promega的。

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O*e
33
Any suggestions other than Sure cells?
Thanks.

【在 n********k 的大作中提到】
: have u tried recommendation incompetent cells, never done it myself but I
: thought those have been
: developed for cloning of this kind...shall be RecA/BCD all minus...

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a*s
34
这种情况我以前也遇到过,后来发现把转化时42度热击的时间从30秒延长到45-50秒就
基本解决了。大片段的插入片段在热击时如果时间不够长的话,就会发生missing部分
片段的情况,推测可能是部分末端的DNA来不及进入E.coli。
BTW:你是不是在用TOPO载体?TOPO对于3kb以下的插入片段好像还稳定,大于3kb的片
段就经常出问题,至少在我手上。我后来换了Promega的T-vector就一直很稳定。
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O*e
35
两种都用过。大片段延长Heat Shock时间不知啥原理,有人有类似经验吗?
还有个实际问题就是,ligation反应之后放-20度,多久之后仍然可以用来做转化?感
觉如果ligate了,应该很稳定吧。大多数manual说可以overnight,有高手放了几天或
更久之后仍然成功转化的吗?我没试过,纯经验请教。
谢谢。

【在 a**********s 的大作中提到】
: 这种情况我以前也遇到过,后来发现把转化时42度热击的时间从30秒延长到45-50秒就
: 基本解决了。大片段的插入片段在热击时如果时间不够长的话,就会发生missing部分
: 片段的情况,推测可能是部分末端的DNA来不及进入E.coli。
: BTW:你是不是在用TOPO载体?TOPO对于3kb以下的插入片段好像还稳定,大于3kb的片
: 段就经常出问题,至少在我手上。我后来换了Promega的T-vector就一直很稳定。

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