z*8
2 楼
从cDNA中PCR一个基因，然后直接用PCR产物测序，发现前后几次的测序结果不一致，请
问为什么？难道是因为cDNA是混合物，导致每次PCR的被扩增模版不同所造成？呼唤遗
传高手！谢谢！
问为什么？难道是因为cDNA是混合物，导致每次PCR的被扩增模版不同所造成？呼唤遗
传高手！谢谢！
h*3
3 楼
http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12274-014-0673-y
MoS2-wrapped silicon nanowires for photoelectrochemical water reduction
Nano Research
January 2015, Volume 8, Issue 1, pp 281-287
MoS2-wrapped silicon nanowires for photoelectrochemical water reduction
Nano Research
January 2015, Volume 8, Issue 1, pp 281-287
l*3
4 楼
香水MM新人我也聊过天。。。怎么就消失了呢：（。。。投
X*n
5 楼
cDNA当然是混合物，同一基因还有不同splicing形式呢。所以应该跑gel, cut the gel
then cloning and sequencing.
then cloning and sequencing.
h*3
6 楼
Thanks a lot, will send Baozi.
f*n
7 楼
顶。。。zilda mm贡献还是很大的，别的不说了，恭祝zilda吉祥如意，富乐安康。
【在 P****m 的大作中提到】
: 活跃版面，及时mark帖子
【在 P****m 的大作中提到】
: 活跃版面，及时mark帖子
z*8
8 楼
抱歉我没说清我的问题。
我想看此基因有无突变，所以从不同病人样本中抽取RNA，然后从cDNA上直接扩增，得
到PCR产物后直接测序，并无克隆过程。
我的困境是，当从同一样本的cDNA上重新PCR送测序，发现结果不一致，于是郁闷了。
谢谢！
我想看此基因有无突变，所以从不同病人样本中抽取RNA，然后从cDNA上直接扩增，得
到PCR产物后直接测序，并无克隆过程。
我的困境是，当从同一样本的cDNA上重新PCR送测序，发现结果不一致，于是郁闷了。
谢谢！
h*3
9 楼
http://scitation.aip.org/content/aip/journal/apl/108/21/10.1063/1.4952739
还要麻烦某位大神给我找一下这篇的supporting information
还要麻烦某位大神给我找一下这篇的supporting information
wh
10 楼
同顶，同祝。
【在 f********n 的大作中提到】
: 顶。。。zilda mm贡献还是很大的，别的不说了，恭祝zilda吉祥如意，富乐安康。
【在 f********n 的大作中提到】
: 顶。。。zilda mm贡献还是很大的，别的不说了，恭祝zilda吉祥如意，富乐安康。
m*7
11 楼
2楼说的没错，你首先确定了你的PCR是单一产物（跑胶一条带）了吗？扩增的片段大小
和理论值一致吗？几次PCR所得到的产物片段大小相同吗？如果扩增产物是混合物，或
几次PCR产物组成不一样，测序结果当然会不一致。
和理论值一致吗？几次PCR所得到的产物片段大小相同吗？如果扩增产物是混合物，或
几次PCR产物组成不一样，测序结果当然会不一致。
s*e
13 楼
支持！！！！！
y*8
14 楼
除非提供更多的步骤细节，否则没法帮你
【在 z**********8 的大作中提到】
: 从cDNA中PCR一个基因，然后直接用PCR产物测序，发现前后几次的测序结果不一致，请
: 问为什么？难道是因为cDNA是混合物，导致每次PCR的被扩增模版不同所造成？呼唤遗
: 传高手！谢谢！
【在 z**********8 的大作中提到】
: 从cDNA中PCR一个基因，然后直接用PCR产物测序，发现前后几次的测序结果不一致，请
: 问为什么？难道是因为cDNA是混合物，导致每次PCR的被扩增模版不同所造成？呼唤遗
: 传高手！谢谢！
b*k
15 楼
支持
g*1
16 楼
二楼标准答案
不过这不是遗传学问题啊。。。。
不过这不是遗传学问题啊。。。。
a*7
17 楼
支持
【在 P****m 的大作中提到】
: 活跃版面，及时mark帖子
【在 P****m 的大作中提到】
: 活跃版面，及时mark帖子
c*r
18 楼
什么不同？是几个base pairs的不同？还是完全不同？总是几个不同？还是每次都不同
？ls说了，要细节。
可能的原因：
1. PCR不够specific，压根就不是你要的东西。解决方法：从新design primers。
2. ls说的，有不同的splicing form。解决方法：从新design splicing specific的
primers。
3. 还有可能你这个测试的sample有污染，比如说如果你测肿瘤细胞，由于genomic
instability，可能会有几个不同的改变，并且混有正常细胞，造成测序不准。
这是个技术问题，根遗传关系不大。
？ls说了，要细节。
可能的原因：
1. PCR不够specific，压根就不是你要的东西。解决方法：从新design primers。
2. ls说的，有不同的splicing form。解决方法：从新design splicing specific的
primers。
3. 还有可能你这个测试的sample有污染，比如说如果你测肿瘤细胞，由于genomic
instability，可能会有几个不同的改变，并且混有正常细胞，造成测序不准。
这是个技术问题，根遗传关系不大。
d*c
19 楼
同支持。
z*8
20 楼
感谢各位热心！
PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
谢谢！
PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
谢谢！
G*r
21 楼
支持一下，无香MM还是很负责的~
s*s
22 楼
你的细胞也不是clone, 测序也测得不是clone，还有啥jjww的。
先clone了你的片段再测序
吗？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 感谢各位热心！
: PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
: 不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
: 个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
: 样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
: 我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
: 胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
: 谢谢！
先clone了你的片段再测序
吗？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 感谢各位热心！
: PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
: 不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
: 个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
: 样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
: 我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
: 胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
: 谢谢！
a*r
23 楼
无香，好想你，好想念我们一起灌水的好时光！
y*8
24 楼
Did you check the raw files from sequencer? Or you just read the FASTA
results.
吗？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 感谢各位热心！
: PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
: 不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
: 个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
: 样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
: 我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
: 胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
: 谢谢！
results.
吗？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 感谢各位热心！
: PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
: 不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
: 个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
: 样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
: 我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
: 胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
: 谢谢！
s*i
25 楼
spt
理由：担任版务工作非常认真，为人热情大方，很有亲和力，是星版给我留下最深印象
的ID，我在星版灌水的一个主要原因就是给zilda捧场。
理由：担任版务工作非常认真，为人热情大方，很有亲和力，是星版给我留下最深印象
的ID，我在星版灌水的一个主要原因就是给zilda捧场。
c*r
26 楼
ok，如果3有可能，那可能是因为你的sample里面混了很多不同来源的DNA，有正常的，
有肿瘤的，不同阶段的肿瘤的。
你说的同一个样本是指同一个tissue提了三次，还是提好的同一个PCR sample测了三次？
由于各种DNA之间的amplification efficiency差不多，所以有可能这次这个dominant
，下次那个dominant。
解决办法就是楼上说的，clone出来，把每个sample取几个不同的clone分别去
sequencing。
我是瞎猜的，是不是这样，需要实验证实。
吗？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 感谢各位热心！
: PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
: 不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
: 个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
: 样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
: 我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
: 胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
: 谢谢！
有肿瘤的，不同阶段的肿瘤的。
你说的同一个样本是指同一个tissue提了三次，还是提好的同一个PCR sample测了三次？
由于各种DNA之间的amplification efficiency差不多，所以有可能这次这个dominant
，下次那个dominant。
解决办法就是楼上说的，clone出来，把每个sample取几个不同的clone分别去
sequencing。
我是瞎猜的，是不是这样，需要实验证实。
吗？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 感谢各位热心！
: PCR片段均经过跑胶后回收。送测序的PCR均特异。不同不是指isoform，也不是SNP。
: 不同一般主要是几个base pair的不同，或碱基突变，或有缺失。有几个样本总是那几
: 个不同，有时与NCBI的database一致，有时有突变。因为有的样本重复过三次了，有的
: 样本可以经重复后得到相同结果，有的得到不一致的结果。我就是郁闷在这里。
: 我觉得clonebar (土星科学院院长)的原因3有可能解释我的问题，我猜测1）有正常细
: 胞混入；2）有些细胞突变了，然而同一样本内细胞突变的情况并不一致，这有可能吗？
: 谢谢！
a*r
27 楼
vote
【在 P****m 的大作中提到】
: 活跃版面，及时mark帖子
【在 P****m 的大作中提到】
: 活跃版面，及时mark帖子
z*8
28 楼
再次谢谢各位！也呼唤做过这方面的兄弟出来！
我做这个之前请教过做这方面的遗传牛人，一般测序病人样本是不需要做克隆的。因为
工作量太大。
关于测序结果，我只有FASTA results.没有running gel的raw data。
这些都不是问题，所以我想请教遗传大牛，一般只有搞突变这方面的才更有经验。
我用的样本是经过抗体瓷珠selected cells，不是tissue。
同一样本是指从一个病人的这些selected cells中提的RNA后RT所得的cDNA，三次PCR指
从同一管cDNA先后进行PCR，然后去测序。不是三次RT。
我做这个之前请教过做这方面的遗传牛人，一般测序病人样本是不需要做克隆的。因为
工作量太大。
关于测序结果，我只有FASTA results.没有running gel的raw data。
这些都不是问题，所以我想请教遗传大牛，一般只有搞突变这方面的才更有经验。
我用的样本是经过抗体瓷珠selected cells，不是tissue。
同一样本是指从一个病人的这些selected cells中提的RNA后RT所得的cDNA，三次PCR指
从同一管cDNA先后进行PCR，然后去测序。不是三次RT。
w*w
29 楼
這麼久了，快出來透透氣吧 ：）
O*e
30 楼
你得首先确认你做的实验，在技术上没有出现问题。比如说这个PCR，你是用的什么
酶？普通的Taq还是其它的？你的PCR产物到底有多大？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 再次谢谢各位！也呼唤做过这方面的兄弟出来！
: 我做这个之前请教过做这方面的遗传牛人，一般测序病人样本是不需要做克隆的。因为
: 工作量太大。
: 关于测序结果，我只有FASTA results.没有running gel的raw data。
: 这些都不是问题，所以我想请教遗传大牛，一般只有搞突变这方面的才更有经验。
: 我用的样本是经过抗体瓷珠selected cells，不是tissue。
: 同一样本是指从一个病人的这些selected cells中提的RNA后RT所得的cDNA，三次PCR指
: 从同一管cDNA先后进行PCR，然后去测序。不是三次RT。
酶？普通的Taq还是其它的？你的PCR产物到底有多大？
【在 z**********8 的大作中提到】
: 再次谢谢各位！也呼唤做过这方面的兄弟出来！
: 我做这个之前请教过做这方面的遗传牛人，一般测序病人样本是不需要做克隆的。因为
: 工作量太大。
: 关于测序结果，我只有FASTA results.没有running gel的raw data。
: 这些都不是问题，所以我想请教遗传大牛，一般只有搞突变这方面的才更有经验。
: 我用的样本是经过抗体瓷珠selected cells，不是tissue。
: 同一样本是指从一个病人的这些selected cells中提的RNA后RT所得的cDNA，三次PCR指
: 从同一管cDNA先后进行PCR，然后去测序。不是三次RT。
z*a
31 楼
@[email protected]
谢谢舞美提名，谢谢大家支持。
梭影想我了？！
【在 w****w 的大作中提到】
: 這麼久了，快出來透透氣吧 ：）
谢谢舞美提名，谢谢大家支持。
梭影想我了？！
【在 w****w 的大作中提到】
: 這麼久了，快出來透透氣吧 ：）
z*8
32 楼
PCR用的是invitrogen的blue mix，应该是普通的。
大小约1kb。
请问同一肿瘤病人的同一类细胞是否可以同时发生多个突变？即这个人有些细胞这个bp
突变，有些那个bp突变。可能吗？我觉得这是遗传问题。
【在 O******e 的大作中提到】
: 你得首先确认你做的实验，在技术上没有出现问题。比如说这个PCR，你是用的什么
: 酶？普通的Taq还是其它的？你的PCR产物到底有多大？
大小约1kb。
请问同一肿瘤病人的同一类细胞是否可以同时发生多个突变？即这个人有些细胞这个bp
突变，有些那个bp突变。可能吗？我觉得这是遗传问题。
【在 O******e 的大作中提到】
: 你得首先确认你做的实验，在技术上没有出现问题。比如说这个PCR，你是用的什么
: 酶？普通的Taq还是其它的？你的PCR产物到底有多大？
w*w
33 楼
LOL, 多謝牛妹給我這個面子啊，哈哈哈哈，我好得意～～
【在 z***a 的大作中提到】
: @[email protected]
: 谢谢舞美提名，谢谢大家支持。
: 梭影想我了？！
【在 z***a 的大作中提到】
: @[email protected]
: 谢谢舞美提名，谢谢大家支持。
: 梭影想我了？！
a*e
34 楼
generally speaking, if your tumor samples come from microdisection,they are
supposed to be a clone and should not contain variations in the same
microdisected sample.
In your case, a regular Taq enzyme can generate several point mutations
during PCR, if the product size is around 1kb.
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: PCR用的是invitrogen的blue mix，应该是普通的。
: 大小约1kb。
: 请问同一肿瘤病人的同一类细胞是否可以同时发生多个突变？即这个人有些细胞这个bp
: 突变，有些那个bp突变。可能吗？我觉得这是遗传问题。
supposed to be a clone and should not contain variations in the same
microdisected sample.
In your case, a regular Taq enzyme can generate several point mutations
during PCR, if the product size is around 1kb.
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: PCR用的是invitrogen的blue mix，应该是普通的。
: 大小约1kb。
: 请问同一肿瘤病人的同一类细胞是否可以同时发生多个突变？即这个人有些细胞这个bp
: 突变，有些那个bp突变。可能吗？我觉得这是遗传问题。
j*1
35 楼
haha ~ support~
n*k
36 楼
No offense....after reading all the replies and ur responses, I would highly
recommend you do some very basic homework before you would come to an
opinion/conclusion about what you might be dealing with...seriously, it
likely will save you tons of times and money...I strongly expect you are
pretty much a greenhand in this field, don't really have a clue what you
might be dealing with.
That said, forget what I said if you are a very experienced one BUT do
reiterate what your questions/problems are in an understandable way...
【在 z**********8 的大作中提到】
: 从cDNA中PCR一个基因，然后直接用PCR产物测序，发现前后几次的测序结果不一致，请
: 问为什么？难道是因为cDNA是混合物，导致每次PCR的被扩增模版不同所造成？呼唤遗
: 传高手！谢谢！
recommend you do some very basic homework before you would come to an
opinion/conclusion about what you might be dealing with...seriously, it
likely will save you tons of times and money...I strongly expect you are
pretty much a greenhand in this field, don't really have a clue what you
might be dealing with.
That said, forget what I said if you are a very experienced one BUT do
reiterate what your questions/problems are in an understandable way...
【在 z**********8 的大作中提到】
: 从cDNA中PCR一个基因，然后直接用PCR产物测序，发现前后几次的测序结果不一致，请
: 问为什么？难道是因为cDNA是混合物，导致每次PCR的被扩增模版不同所造成？呼唤遗
: 传高手！谢谢！
a*r
37 楼
无香回来啦，使劲抱抱啊：D
【在 z***a 的大作中提到】
: @[email protected]
: 谢谢舞美提名，谢谢大家支持。
: 梭影想我了？！
【在 z***a 的大作中提到】
: @[email protected]
: 谢谢舞美提名，谢谢大家支持。
: 梭影想我了？！
O*e
38 楼
ahche已经说过了，你得首先确认你的PCR-PCR过程中没有引入突变，其次才应该考虑
遗传学上的那些“大问题”。
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: PCR用的是invitrogen的blue mix，应该是普通的。
: 大小约1kb。
: 请问同一肿瘤病人的同一类细胞是否可以同时发生多个突变？即这个人有些细胞这个bp
: 突变，有些那个bp突变。可能吗？我觉得这是遗传问题。
遗传学上的那些“大问题”。
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: PCR用的是invitrogen的blue mix，应该是普通的。
: 大小约1kb。
: 请问同一肿瘤病人的同一类细胞是否可以同时发生多个突变？即这个人有些细胞这个bp
: 突变，有些那个bp突变。可能吗？我觉得这是遗传问题。
z*8
39 楼
谢谢各位参与讨论!
我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
PCR再酶切的方法去筛.
我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
帖了.
回到问题,我有些奇怪的猜测,希望遗传朋友或懂测序的朋友指点.
1)有无可能有些肿瘤细胞出现三倍体? 有些细胞仍正常.
2)若突变细胞只是所有细胞一部分,会否导致缺失突变被测序时,两条链高低不等? 可相
差几倍吗? 一般的概念是等峰,我有些突变是这样.可还有些总是测序FASTA峰值差很多.
是否是因为突变的细胞比例低所致?
谢谢!
我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
PCR再酶切的方法去筛.
我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
帖了.
回到问题,我有些奇怪的猜测,希望遗传朋友或懂测序的朋友指点.
1)有无可能有些肿瘤细胞出现三倍体? 有些细胞仍正常.
2)若突变细胞只是所有细胞一部分,会否导致缺失突变被测序时,两条链高低不等? 可相
差几倍吗? 一般的概念是等峰,我有些突变是这样.可还有些总是测序FASTA峰值差很多.
是否是因为突变的细胞比例低所致?
谢谢!
a*e
40 楼
the problem here is that you can't repeat your data ! That has to be an
error in the experiment.
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: 谢谢各位参与讨论!
: 我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
: 大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
: 接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
: 寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
: 合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
: 筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
: PCR再酶切的方法去筛.
: 我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
: 都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
error in the experiment.
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: 谢谢各位参与讨论!
: 我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
: 大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
: 接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
: 寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
: 合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
: 筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
: PCR再酶切的方法去筛.
: 我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
: 都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
O*e
41 楼
you really really missed the points
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: 谢谢各位参与讨论!
: 我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
: 大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
: 接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
: 寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
: 合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
: 筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
: PCR再酶切的方法去筛.
: 我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
: 都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
bp
【在 z**********8 的大作中提到】
: 谢谢各位参与讨论!
: 我用我浅薄的遗传学知识为大家解释一下突变的问题.
: 大家说的PCR致突变大都是指做克隆时发生的点突变,做克隆时PCR酶可以导致点突变,连
: 接后单克隆挑出再提质粒后再测序,如果有突变,大多是这种情况.
: 寻找病人的基因突变不是这样的,因为每个病人做克隆是不现实的,而且很多突变不是纯
: 合,杂合突变如果去做克隆,没法选择挑几个克隆才合理或有可能的得到那个突变.所以
: 筛选病人突变时,不能用克隆的方法,而多用PCR产物直接测序,或者为了更省钱,设计好
: PCR再酶切的方法去筛.
: 我因为是用PCR产物直接测序,这是个混合物,即时有些bp突变,不可能所有片段的那个bp
: 都突变,所以这就保证只有真正的突变才能被测序出来.因此,质疑PCR的朋友请不必再回
O*e
42 楼
我也快受不了他啦，^_^
【在 a***e 的大作中提到】
: the problem here is that you can't repeat your data ! That has to be an
: error in the experiment.
:
: bp
【在 a***e 的大作中提到】
: the problem here is that you can't repeat your data ! That has to be an
: error in the experiment.
:
: bp
n*k
43 楼
well, it is somewhat more comprehensible this time...but it is so evident that you are the only and the very expert on the research area...so I guess
you would have to help yourself out by doing some homework:)) now...good luck,
there...
you would have to help yourself out by doing some homework:)) now...good luck,
there...
n*k
44 楼
/..\
【在 O******e 的大作中提到】
: 我也快受不了他啦，^_^
【在 O******e 的大作中提到】
: 我也快受不了他啦，^_^
n*k
45 楼
on paper, this may or may not neccesarrily be true...however, in this
particular case, I would have to agree with your instinct:))
【在 a***e 的大作中提到】
: the problem here is that you can't repeat your data ! That has to be an
: error in the experiment.
:
: bp
particular case, I would have to agree with your instinct:))
【在 a***e 的大作中提到】
: the problem here is that you can't repeat your data ! That has to be an
: error in the experiment.
:
: bp
z*8
46 楼
我很奇怪问问题也要被嘲笑一通，而且版主也来。。。
如果问题可笑，那能让大家笑笑也好
我就是因为不能完全repeat，所以请教是否肿瘤细胞会有部分突变而另一部分不突变的
可能性？为何觉得我的实验做错了？技术方面大家都这样做的。难道我还要被怀疑样本
搞错？
唉，无语
想起那句“小样，你新来的吧？”
如果问题可笑，那能让大家笑笑也好
我就是因为不能完全repeat，所以请教是否肿瘤细胞会有部分突变而另一部分不突变的
可能性？为何觉得我的实验做错了？技术方面大家都这样做的。难道我还要被怀疑样本
搞错？
唉，无语
想起那句“小样，你新来的吧？”
n*k
47 楼
frankly people try to help you but u kind of refuse to be helped...it could
also be we are just so layman about ur problems...so neither case would help
ur situation...anyway, a closed mind is a wonderful thing to lose...if u
are a newbie in research such as a junior graduate, then check very basics
first before u think too mysterious about ur problems, more often than not
just a trivial matter...just my two cents and good luck
【在 z**********8 的大作中提到】
: 我很奇怪问问题也要被嘲笑一通，而且版主也来。。。
: 如果问题可笑，那能让大家笑笑也好
: 我就是因为不能完全repeat，所以请教是否肿瘤细胞会有部分突变而另一部分不突变的
: 可能性？为何觉得我的实验做错了？技术方面大家都这样做的。难道我还要被怀疑样本
: 搞错？
: 唉，无语
: 想起那句“小样，你新来的吧？”
also be we are just so layman about ur problems...so neither case would help
ur situation...anyway, a closed mind is a wonderful thing to lose...if u
are a newbie in research such as a junior graduate, then check very basics
first before u think too mysterious about ur problems, more often than not
just a trivial matter...just my two cents and good luck
【在 z**********8 的大作中提到】
: 我很奇怪问问题也要被嘲笑一通，而且版主也来。。。
: 如果问题可笑，那能让大家笑笑也好
: 我就是因为不能完全repeat，所以请教是否肿瘤细胞会有部分突变而另一部分不突变的
: 可能性？为何觉得我的实验做错了？技术方面大家都这样做的。难道我还要被怀疑样本
: 搞错？
: 唉，无语
: 想起那句“小样，你新来的吧？”
z*8
48 楼
Thanks to your input!
Would you please recommend any books or papers about this problem? Thank you.
could
help
【在 n********k 的大作中提到】
: frankly people try to help you but u kind of refuse to be helped...it could
: also be we are just so layman about ur problems...so neither case would help
: ur situation...anyway, a closed mind is a wonderful thing to lose...if u
: are a newbie in research such as a junior graduate, then check very basics
: first before u think too mysterious about ur problems, more often than not
: just a trivial matter...just my two cents and good luck
Would you please recommend any books or papers about this problem? Thank you.
could
help
【在 n********k 的大作中提到】
: frankly people try to help you but u kind of refuse to be helped...it could
: also be we are just so layman about ur problems...so neither case would help
: ur situation...anyway, a closed mind is a wonderful thing to lose...if u
: are a newbie in research such as a junior graduate, then check very basics
: first before u think too mysterious about ur problems, more often than not
: just a trivial matter...just my two cents and good luck
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