请教E. coli 表达的蛋白90% 以上被degrade的掉，怎么避免？ - 未名空间MITBBS历史存档

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请教E. coli 表达的蛋白90% 以上被degrade的掉，怎么避免？

请教E. coli 表达的蛋白90% 以上被degrade的掉，怎么避免？# Biology - 生物学

c*t2010-03-02 08:03

1 楼

【以下文字转载自 Music 讨论区】
发信人: childheart (青凉酒), 信区: Music
标题: Re: 【技术】childheart -- 俺找到学习的方法了
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 23 00:55:28 2012, 美东)
欢迎拍砖！
【清唱】childheart--嘎达梅林
作词宝音楚古拉
作曲孟和
原唱齐峰
南方飞来的小鸿雁啊
不落长江不呀不起飞
要说造反的嘎达梅林
是为了蒙古人民的土地
北方飞来的大鸿雁啊
不落长江不呀不起飞
要说造反的嘎达梅林
是为了蒙古人民的土地
天上的鸿雁从南往北飞
是为了追求太阳的温暖
反抗王爷的嘎达梅林
是为了蒙古人民的利益
天上的鸿雁从北往南飞
是为了躲避北海的寒冷
造反起义的嘎达梅林
是为了蒙古人民的利益
嘎达梅林试听说明【在 childheart (青凉酒) 的大作中提到: 】

M*e2010-03-02 08:03

2 楼

1 more call drop per 100 phone calls...
如果正常的3Gs phone call drop rate是 1/100,那这个drop rate就double了。
如果是1/1000，那这个就十倍了。。。
另外说只有0.55%的用户抱怨天线，那剩下的99%的用户都打电话干什么来了？
看来iPhone 4还有更大的问题啊。呵呵

D*s2010-03-02 08:03

3 楼

要表达一个全长40KD的蛋白，用的是pET32a+ vector. 转化入BL21(DE3) bacteria.
Western 显示full-length protein只有大约10%，主要被降解成2条非常强的band.
而只表达这个蛋白的fragment（大约一半，20KD), 就没有蛋白降解的发生。
请问有什么好的建议？谢谢

j*u2010-03-02 08:03

4 楼

好听。。。

【在 c********t 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 Music 讨论区】
: 发信人: childheart (青凉酒), 信区: Music
: 标题: Re: 【技术】childheart -- 俺找到学习的方法了
: 发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 23 00:55:28 2012, 美东)
: 欢迎拍砖！
: 【清唱】childheart--嘎达梅林
: 作词宝音楚古拉
: 作曲孟和
: 原唱齐峰
: 南方飞来的小鸿雁啊

P*e2010-03-02 08:03

5 楼

关键大家知道打电话也没用，所有人都这么个问题

【在 M*****e 的大作中提到】

: 1 more call drop per 100 phone calls...
: 如果正常的3Gs phone call drop rate是 1/100,那这个drop rate就double了。
: 如果是1/1000，那这个就十倍了。。。
: 另外说只有0.55%的用户抱怨天线，那剩下的99%的用户都打电话干什么来了？
: 看来iPhone 4还有更大的问题啊。呵呵

b*r2010-03-02 08:03

6 楼

well, if you are doing crystallography then 20kda protein is fine
unless the part that's getting degraded is something they're interested in
looking at
if you wants to save it, i would try coexpressing the protein with a
binding partner
that binds the region that's getting degraded
hopefully the binding partner can stabilize it
so that it won't get degraded

c*t2010-03-02 08:03

7 楼

谢谢你！

【在 j******u 的大作中提到】

: 好听。。。

t*u2010-03-02 08:03

8 楼

可能是call activation , activation不容易的说如果不是熟悉的话

【在 M*****e 的大作中提到】

b*r2010-03-02 08:03

9 楼

the other thing is
you can try coexpressing the same protein
but use truncations
like you expresses the 20kd fragment
and then expresses the other 20kd fragment as well
and put them together
some times if the two domains are tightly linked
and just have a small flexible linker
some times if u just coexpress them together
they end up touching each other enough
in all honesty
if you doing crystallography
he should just do the two fragments and put them in the xtal tray
as long as you wait for the

M*e2010-03-02 08:03

10 楼

我估计也是把这类的客服算进去了。
总之apple这次做的不厚道。
免费赠送套子已经是最低限度的解决方案了，
还要在前面找的这些借口即在同行里挑起无谓的矛盾，
又显得他们自己不敢于担当，避重就轻。

【在 t******u 的大作中提到】

: 可能是call activation , activation不容易的说如果不是熟悉的话

b*n2010-03-02 08:03

11 楼

如果加足了蛋白酶抑制剂和低温操作还是这样的话
该蛋白有自我催化降解功能？

【在 D****s 的大作中提到】

: 要表达一个全长40KD的蛋白，用的是pET32a+ vector. 转化入BL21(DE3) bacteria.
: Western 显示full-length protein只有大约10%，主要被降解成2条非常强的band.
: 而只表达这个蛋白的fragment（大约一半，20KD), 就没有蛋白降解的发生。
: 请问有什么好的建议？谢谢

p*m2010-03-02 08:03

12 楼

用iphone的同学们打911要是断了就残念了

D*s2010-03-02 08:03

13 楼

此蛋白是一个ubiquitin E3 ligase. 加了蛋白酶抑制剂并且是低温操作，还是绝大部
分蛋白被降解。感觉降解应该发生在收菌以前。我需要表达纯化全长的此蛋白。
请问这种情况，换一个E.coli host strain 来表达会有效果吗？

j*n2010-03-02 08:03

14 楼

我以为2、3楼朋友说的策略不见得有效。也很难找到可以结合后保护断裂位点的合适蛋
白，共转什么的，也很麻烦。我们实验室也用过类似的办法，不太奏效。
我觉得可行的一是你看一下大概什么位置断掉的，突变一下相应的氨基酸；二是可以换
其他的表达系统，就是不用细菌的，比如昆虫细胞。
如果一定要获得全长表达的蛋白，再完成后续研究，有时是很困难的。
你在大量表达前没有做小的test么？什么时候降解的，应该是可以在test里看出的啊。
如果test的时候就得不到全长表达的蛋白，还做后面的大量表达有什么意义呢？呵呵……
即便是在大量表达，你的裂解样品，过柱液，清洗液，洗脱液，纯化后的，都跑SDS-
PAGE了么？从开始就降解的，还是过程中呢？感觉降解发生在哪里，呵呵，我相信女士
的感觉一般很准，但咱这是科学研究，不是猜猜看，你说呢？

b*n2010-03-02 08:03

15 楼

你试过低温表达了吗？比如说30度或者25度
温度低可能蛋白降解会慢一点
另外表达的时候可以尝试加3%左右的乙醇看看效果
你是不是纯化之后过柱再做的western？
如果没问题，能否将序列和western电泳图（最好有marker）发给我看看
s****[email protected]
反正蛋白纯化是门艺术，不同蛋白纯化方法不同
多试试看运气吧

【在 D****s 的大作中提到】

: 此蛋白是一个ubiquitin E3 ligase. 加了蛋白酶抑制剂并且是低温操作，还是绝大部
: 分蛋白被降解。感觉降解应该发生在收菌以前。我需要表达纯化全长的此蛋白。
: 请问这种情况，换一个E.coli host strain 来表达会有效果吗？

g*n2010-03-02 08:03

16 楼

加3%的乙醇是什么作用呢？