问个单链DNA连接的问题# Biology - 生物学
j*2
1 楼
有没有人在bank of west已经pay bill 10次后拿到100刀的bonus的？请问有没有全部
pay给自己十次 ，这样可行吗？目前还没拿到卡～～～存了100刀
pay给自己十次 ，这样可行吗？目前还没拿到卡～～～存了100刀
g*t
2 楼
如果你需要给你的父母或者配偶申请ITIN， 不需要一定邮寄他们的护照原件， 也不需
要去中国领事馆Certify.
他们可以拿护照去中国的美领馆Certify 护照， 一个人50美元。 -- 北京有IRS办公室
， 如果你在那里Certify的话， 是免费的。
你也可以把美国的税表交到IRS北京办事处， 不一定是寄到美国的IRS。
然后， 你用这个美领馆Certify的护照复印页就可以申请ITIN了。
要去中国领事馆Certify.
他们可以拿护照去中国的美领馆Certify 护照， 一个人50美元。 -- 北京有IRS办公室
， 如果你在那里Certify的话， 是免费的。
你也可以把美国的税表交到IRS北京办事处， 不一定是寄到美国的IRS。
然后， 你用这个美领馆Certify的护照复印页就可以申请ITIN了。
s*n
3 楼
我一般是选择默认风格 曲线都是调好的。总想着是不是再手动调一下会更好。RGB曲线
就更复杂了 3条曲线啊~~
请问大师们后期怎么处理曲线调整的？
就更复杂了 3条曲线啊~~
请问大师们后期怎么处理曲线调整的？
P*s
4 楼
岳云鹏能够获得欢乐喜剧人的冠军，可能跟他的光头师傅郭德纲有点关系，但
关系不会太大，毕竟观众也都是理性的评判者。按照惯例，说相声的人的喜剧感染力远
远没有演小品的人的感染力那么强，赵本山随便说句话就能让你笑半天，而相声你听过
以后几秒钟就忘了讲的是什么。在传统的戏剧界里，小品总是给人们带来更多的欢笑，
好像喜剧界的半个江山都是给小品的。而相声这种艺术形式却总是躲在孤独的角落里，
你会发现在欢乐喜剧人的节目里，相声出现的次数很少，上一季里有十来个组，里面大
概只有高晓攀是说相声的吧，其他人家都是以演小品见长。直观的感受是，相声从来都
是被严重排挤和不受重视的。而从传统相声给人的印象来看，相声也没有多大的骨气，
总是在同样死板的套路里打转，相声人们在艰苦而又痛苦的情况下坚持着相声事业。而
岳云鹏的出现，给相声带来生机。他把相声这种艺术形式演活了，演的更生活更贴近了
，把这种艺术形式演到人们心里去了。这改变了人们对相声这种喜剧方式的认识，可以
说是颠覆性的。看完小岳的作品，大家不由惊讶，哦，原来相声也可以这么搞笑。岳云
鹏如果演小品肯定斗不过小沈阳，但是他演了相声而且把它演活这就是一大成功。他能
获得冠军都是因为他选择了相声。他把相声赋予了生命，而相声也给他争得了荣誉。他
们彼此骄傲。
关系不会太大，毕竟观众也都是理性的评判者。按照惯例，说相声的人的喜剧感染力远
远没有演小品的人的感染力那么强，赵本山随便说句话就能让你笑半天，而相声你听过
以后几秒钟就忘了讲的是什么。在传统的戏剧界里，小品总是给人们带来更多的欢笑，
好像喜剧界的半个江山都是给小品的。而相声这种艺术形式却总是躲在孤独的角落里，
你会发现在欢乐喜剧人的节目里，相声出现的次数很少，上一季里有十来个组，里面大
概只有高晓攀是说相声的吧，其他人家都是以演小品见长。直观的感受是，相声从来都
是被严重排挤和不受重视的。而从传统相声给人的印象来看，相声也没有多大的骨气，
总是在同样死板的套路里打转，相声人们在艰苦而又痛苦的情况下坚持着相声事业。而
岳云鹏的出现，给相声带来生机。他把相声这种艺术形式演活了，演的更生活更贴近了
，把这种艺术形式演到人们心里去了。这改变了人们对相声这种喜剧方式的认识，可以
说是颠覆性的。看完小岳的作品，大家不由惊讶，哦，原来相声也可以这么搞笑。岳云
鹏如果演小品肯定斗不过小沈阳，但是他演了相声而且把它演活这就是一大成功。他能
获得冠军都是因为他选择了相声。他把相声赋予了生命，而相声也给他争得了荣誉。他
们彼此骄傲。
a*e
5 楼
我在用Taq DNA ligase将两个富含GC的约70bp的单链DNA片段连接。 直接连，没连上。
又95度加热10分钟，cool down overnight，再连接，还是没连上。 请教各位有什么建
议么？
另外如果把单链变为双链后再连接，怎么由双链的DNA在获得单链。 Thanks
又95度加热10分钟，cool down overnight，再连接，还是没连上。 请教各位有什么建
议么？
另外如果把单链变为双链后再连接，怎么由双链的DNA在获得单链。 Thanks
y*i
6 楼
西联? Bank of the West? //hoho
【在 j*****2 的大作中提到】
: 有没有人在bank of west已经pay bill 10次后拿到100刀的bonus的？请问有没有全部
: pay给自己十次 ，这样可行吗？目前还没拿到卡～～～存了100刀
【在 j*****2 的大作中提到】
: 有没有人在bank of west已经pay bill 10次后拿到100刀的bonus的？请问有没有全部
: pay给自己十次 ，这样可行吗？目前还没拿到卡～～～存了100刀
s*y
7 楼
IRS网站上不是说一定要原件 而且需要本人到场吗？
s*y
8 楼
FT! FT! FT!
Of course you cannot ligate the single strand DNA like this way! Because
there is NOTHING to hold these two fragments together to allow the ligase to
act.
If you really want to ligate the single strand DNA, at least you should use
some kind of carrier system like BSA or other stuffs like a non-specific DNA
-binding protein.
If you choose to ligate from the double strand DNA, you can of course break
it down to single strand by incubating them on high temperature with
denaturing reagen
【在 a******e 的大作中提到】
: 我在用Taq DNA ligase将两个富含GC的约70bp的单链DNA片段连接。 直接连，没连上。
: 又95度加热10分钟，cool down overnight，再连接，还是没连上。 请教各位有什么建
: 议么？
: 另外如果把单链变为双链后再连接，怎么由双链的DNA在获得单链。 Thanks
Of course you cannot ligate the single strand DNA like this way! Because
there is NOTHING to hold these two fragments together to allow the ligase to
act.
If you really want to ligate the single strand DNA, at least you should use
some kind of carrier system like BSA or other stuffs like a non-specific DNA
-binding protein.
If you choose to ligate from the double strand DNA, you can of course break
it down to single strand by incubating them on high temperature with
denaturing reagen
【在 a******e 的大作中提到】
: 我在用Taq DNA ligase将两个富含GC的约70bp的单链DNA片段连接。 直接连，没连上。
: 又95度加热10分钟，cool down overnight，再连接，还是没连上。 请教各位有什么建
: 议么？
: 另外如果把单链变为双链后再连接，怎么由双链的DNA在获得单链。 Thanks
z*u
9 楼
我拿到了
但是我是分十次pay 信用卡的
但是我是分十次pay 信用卡的
g*t
10 楼
首先， IRS从没说过一定要原件。 也从没提过一定要本人到场
花半个小时仔细读读IRS文件， 就会清楚了
【在 s********y 的大作中提到】
: IRS网站上不是说一定要原件 而且需要本人到场吗？
花半个小时仔细读读IRS文件， 就会清楚了
【在 s********y 的大作中提到】
: IRS网站上不是说一定要原件 而且需要本人到场吗？
a*e
11 楼
you need a bridge DNA.
check NEB
Taq DNA Ligase catalyzes the formation of a phosphodiester bond between
juxtaposed 5′ phosphate and 3′ hydroxyl termini of two adjacent
oligonucleotides which are hybridized to a complementary target DNA. The
ligation will occur only if the oligonucleotides are perfectly paired to the
complementary target DNA and have no gaps between them; therefore, a single
-base substitution can be detected. Taq DNA Ligase is active at elevated
temperatures (45°C-65°C) (1,2).
check NEB
Taq DNA Ligase catalyzes the formation of a phosphodiester bond between
juxtaposed 5′ phosphate and 3′ hydroxyl termini of two adjacent
oligonucleotides which are hybridized to a complementary target DNA. The
ligation will occur only if the oligonucleotides are perfectly paired to the
complementary target DNA and have no gaps between them; therefore, a single
-base substitution can be detected. Taq DNA Ligase is active at elevated
temperatures (45°C-65°C) (1,2).
j*2
12 楼
请问它家是多久后给你bonus的？
【在 z*****u 的大作中提到】
: 我拿到了
: 但是我是分十次pay 信用卡的
【在 z*****u 的大作中提到】
: 我拿到了
: 但是我是分十次pay 信用卡的
s*y
13 楼
http://www.irs.gov/uac/ITIN-Authenticating-TACs-Link
*Individual Taxpayer Identification Number (ITIN) Authenticating Taxpayer
Assistance Centers
All ITIN applicants, including children, must appear in person at the time
the Form W-7, Application for IRS Individual Taxpayer Identification Number,
is submitted to have their passport and/or national identification card
returned the same day.
*This office will review original passports and national identification
cards only.
*All other original documentation and copies of documentation certified by
issuing agencies will be forwarded with the Form W-7 application to the IRS
ITIN Office.
*Individual Taxpayer Identification Number (ITIN) Authenticating Taxpayer
Assistance Centers
All ITIN applicants, including children, must appear in person at the time
the Form W-7, Application for IRS Individual Taxpayer Identification Number,
is submitted to have their passport and/or national identification card
returned the same day.
*This office will review original passports and national identification
cards only.
*All other original documentation and copies of documentation certified by
issuing agencies will be forwarded with the Form W-7 application to the IRS
ITIN Office.
a*e
14 楼
sorry， 忘记说明了， 我用了complementary target DNA。 我用的反应条件是室温，
反应2个小时。
the
single
【在 a***e 的大作中提到】
: you need a bridge DNA.
: check NEB
: Taq DNA Ligase catalyzes the formation of a phosphodiester bond between
: juxtaposed 5′ phosphate and 3′ hydroxyl termini of two adjacent
: oligonucleotides which are hybridized to a complementary target DNA. The
: ligation will occur only if the oligonucleotides are perfectly paired to the
: complementary target DNA and have no gaps between them; therefore, a single
: -base substitution can be detected. Taq DNA Ligase is active at elevated
: temperatures (45°C-65°C) (1,2).
反应2个小时。
the
single
【在 a***e 的大作中提到】
: you need a bridge DNA.
: check NEB
: Taq DNA Ligase catalyzes the formation of a phosphodiester bond between
: juxtaposed 5′ phosphate and 3′ hydroxyl termini of two adjacent
: oligonucleotides which are hybridized to a complementary target DNA. The
: ligation will occur only if the oligonucleotides are perfectly paired to the
: complementary target DNA and have no gaps between them; therefore, a single
: -base substitution can be detected. Taq DNA Ligase is active at elevated
: temperatures (45°C-65°C) (1,2).
z*u
15 楼
快两个月吧
你就耐心等等吧
你就耐心等等吧
c*t
16 楼
请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
j*2
17 楼
请问这个10次paybill是不是从申请那天开始算起的60天之内pay完？
【在 z*****u 的大作中提到】
: 快两个月吧
: 你就耐心等等吧
【在 z*****u 的大作中提到】
: 快两个月吧
: 你就耐心等等吧
s*y
18 楼
co ask
【在 c******t 的大作中提到】
: 请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
【在 c******t 的大作中提到】
: 请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
g*t
19 楼
这是到IRS TAC申请 ITIN。 只是申请ITIN验证证件的多种方法之一， 不是唯一。。。。
Number,
【在 s********y 的大作中提到】
: http://www.irs.gov/uac/ITIN-Authenticating-TACs-Link
: *Individual Taxpayer Identification Number (ITIN) Authenticating Taxpayer
: Assistance Centers
: All ITIN applicants, including children, must appear in person at the time
: the Form W-7, Application for IRS Individual Taxpayer Identification Number,
: is submitted to have their passport and/or national identification card
: returned the same day.
: *This office will review original passports and national identification
: cards only.
: *All other original documentation and copies of documentation certified by
Number,
【在 s********y 的大作中提到】
: http://www.irs.gov/uac/ITIN-Authenticating-TACs-Link
: *Individual Taxpayer Identification Number (ITIN) Authenticating Taxpayer
: Assistance Centers
: All ITIN applicants, including children, must appear in person at the time
: the Form W-7, Application for IRS Individual Taxpayer Identification Number,
: is submitted to have their passport and/or national identification card
: returned the same day.
: *This office will review original passports and national identification
: cards only.
: *All other original documentation and copies of documentation certified by
g*t
20 楼
你可以全程邮寄。
我们是在国内的美领馆验证的中国护照（人去的领馆）。 然后用美领馆盖章的护照复
印页去申请的ITIN和报税的， 寄到Austin。
【在 c******t 的大作中提到】
: 请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
我们是在国内的美领馆验证的中国护照（人去的领馆）。 然后用美领馆盖章的护照复
印页去申请的ITIN和报税的， 寄到Austin。
【在 c******t 的大作中提到】
: 请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
s*y
21 楼
去领馆的人需要准备哪些材料呢？
目前准备了护照原件以及复印件，结婚证原件，配偶的签证，护照复印件
谢谢了
需要写个什么信之类的吗？
【在 g*******t 的大作中提到】
: 你可以全程邮寄。
: 我们是在国内的美领馆验证的中国护照（人去的领馆）。 然后用美领馆盖章的护照复
: 印页去申请的ITIN和报税的， 寄到Austin。
目前准备了护照原件以及复印件，结婚证原件，配偶的签证，护照复印件
谢谢了
需要写个什么信之类的吗？
【在 g*******t 的大作中提到】
: 你可以全程邮寄。
: 我们是在国内的美领馆验证的中国护照（人去的领馆）。 然后用美领馆盖章的护照复
: 印页去申请的ITIN和报税的， 寄到Austin。
g*t
22 楼
应该护照原件和复印件就够了。
50 美元可以刷卡付。
【在 s********y 的大作中提到】
: 去领馆的人需要准备哪些材料呢？
: 目前准备了护照原件以及复印件，结婚证原件，配偶的签证，护照复印件
: 谢谢了
: 需要写个什么信之类的吗？
50 美元可以刷卡付。
【在 s********y 的大作中提到】
: 去领馆的人需要准备哪些材料呢？
: 目前准备了护照原件以及复印件，结婚证原件，配偶的签证，护照复印件
: 谢谢了
: 需要写个什么信之类的吗？
g*t
23 楼
如果你需要给你的父母或者配偶申请ITIN， 不需要一定邮寄他们的护照原件， 也不需
要去中国领事馆Certify.
他们可以拿护照去中国的美领馆Certify 护照， 一个人50美元。 -- 北京有IRS办公室
， 如果你在那里Certify的话， 是免费的。
你也可以把美国的税表交到IRS北京办事处， 不一定是寄到美国的IRS。
然后， 你用这个美领馆Certify的护照复印页就可以申请ITIN了。
要去中国领事馆Certify.
他们可以拿护照去中国的美领馆Certify 护照， 一个人50美元。 -- 北京有IRS办公室
， 如果你在那里Certify的话， 是免费的。
你也可以把美国的税表交到IRS北京办事处， 不一定是寄到美国的IRS。
然后， 你用这个美领馆Certify的护照复印页就可以申请ITIN了。
s*y
24 楼
IRS网站上不是说一定要原件 而且需要本人到场吗？
g*t
25 楼
首先， IRS从没说过一定要原件。 也从没提过一定要本人到场
花半个小时仔细读读IRS文件， 就会清楚了
【在 s********y 的大作中提到】
: IRS网站上不是说一定要原件 而且需要本人到场吗？
花半个小时仔细读读IRS文件， 就会清楚了
【在 s********y 的大作中提到】
: IRS网站上不是说一定要原件 而且需要本人到场吗？
s*y
26 楼
http://www.irs.gov/uac/ITIN-Authenticating-TACs-Link
*Individual Taxpayer Identification Number (ITIN) Authenticating Taxpayer
Assistance Centers
All ITIN applicants, including children, must appear in person at the time
the Form W-7, Application for IRS Individual Taxpayer Identification Number,
is submitted to have their passport and/or national identification card
returned the same day.
*This office will review original passports and national identification
cards only.
*All other original documentation and copies of documentation certified by
issuing agencies will be forwarded with the Form W-7 application to the IRS
ITIN Office.
*Individual Taxpayer Identification Number (ITIN) Authenticating Taxpayer
Assistance Centers
All ITIN applicants, including children, must appear in person at the time
the Form W-7, Application for IRS Individual Taxpayer Identification Number,
is submitted to have their passport and/or national identification card
returned the same day.
*This office will review original passports and national identification
cards only.
*All other original documentation and copies of documentation certified by
issuing agencies will be forwarded with the Form W-7 application to the IRS
ITIN Office.
c*t
27 楼
请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
s*y
28 楼
co ask
【在 c******t 的大作中提到】
: 请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
【在 c******t 的大作中提到】
: 请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
g*t
29 楼
这是到IRS TAC申请 ITIN。 只是申请ITIN验证证件的多种方法之一， 不是唯一。。。。
Number,
【在 s********y 的大作中提到】
: http://www.irs.gov/uac/ITIN-Authenticating-TACs-Link
: *Individual Taxpayer Identification Number (ITIN) Authenticating Taxpayer
: Assistance Centers
: All ITIN applicants, including children, must appear in person at the time
: the Form W-7, Application for IRS Individual Taxpayer Identification Number,
: is submitted to have their passport and/or national identification card
: returned the same day.
: *This office will review original passports and national identification
: cards only.
: *All other original documentation and copies of documentation certified by
Number,
【在 s********y 的大作中提到】
: http://www.irs.gov/uac/ITIN-Authenticating-TACs-Link
: *Individual Taxpayer Identification Number (ITIN) Authenticating Taxpayer
: Assistance Centers
: All ITIN applicants, including children, must appear in person at the time
: the Form W-7, Application for IRS Individual Taxpayer Identification Number,
: is submitted to have their passport and/or national identification card
: returned the same day.
: *This office will review original passports and national identification
: cards only.
: *All other original documentation and copies of documentation certified by
g*t
30 楼
你可以全程邮寄。
我们是在国内的美领馆验证的中国护照（人去的领馆）。 然后用美领馆盖章的护照复
印页去申请的ITIN和报税的， 寄到Austin。
【在 c******t 的大作中提到】
: 请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
我们是在国内的美领馆验证的中国护照（人去的领馆）。 然后用美领馆盖章的护照复
印页去申请的ITIN和报税的， 寄到Austin。
【在 c******t 的大作中提到】
: 请问楼主你知道具体办理的流程吗？可以邮寄办理吗？
s*y
31 楼
去领馆的人需要准备哪些材料呢？
目前准备了护照原件以及复印件，结婚证原件，配偶的签证，护照复印件
谢谢了
需要写个什么信之类的吗？
【在 g*******t 的大作中提到】
: 你可以全程邮寄。
: 我们是在国内的美领馆验证的中国护照（人去的领馆）。 然后用美领馆盖章的护照复
: 印页去申请的ITIN和报税的， 寄到Austin。
目前准备了护照原件以及复印件，结婚证原件，配偶的签证，护照复印件
谢谢了
需要写个什么信之类的吗？
【在 g*******t 的大作中提到】
: 你可以全程邮寄。
: 我们是在国内的美领馆验证的中国护照（人去的领馆）。 然后用美领馆盖章的护照复
: 印页去申请的ITIN和报税的， 寄到Austin。
g*t
32 楼
应该护照原件和复印件就够了。
50 美元可以刷卡付。
【在 s********y 的大作中提到】
: 去领馆的人需要准备哪些材料呢？
: 目前准备了护照原件以及复印件，结婚证原件，配偶的签证，护照复印件
: 谢谢了
: 需要写个什么信之类的吗？
50 美元可以刷卡付。
【在 s********y 的大作中提到】
: 去领馆的人需要准备哪些材料呢？
: 目前准备了护照原件以及复印件，结婚证原件，配偶的签证，护照复印件
: 谢谢了
: 需要写个什么信之类的吗？
C*y
33 楼
Di my parents need to be in Beijing for passport certification?
Thank you,
【在 g*******t 的大作中提到】
: 如果你需要给你的父母或者配偶申请ITIN， 不需要一定邮寄他们的护照原件， 也不需
: 要去中国领事馆Certify.
: 他们可以拿护照去中国的美领馆Certify 护照， 一个人50美元。 -- 北京有IRS办公室
: ， 如果你在那里Certify的话， 是免费的。
: 你也可以把美国的税表交到IRS北京办事处， 不一定是寄到美国的IRS。
: 然后， 你用这个美领馆Certify的护照复印页就可以申请ITIN了。
Thank you,
【在 g*******t 的大作中提到】
: 如果你需要给你的父母或者配偶申请ITIN， 不需要一定邮寄他们的护照原件， 也不需
: 要去中国领事馆Certify.
: 他们可以拿护照去中国的美领馆Certify 护照， 一个人50美元。 -- 北京有IRS办公室
: ， 如果你在那里Certify的话， 是免费的。
: 你也可以把美国的税表交到IRS北京办事处， 不一定是寄到美国的IRS。
: 然后， 你用这个美领馆Certify的护照复印页就可以申请ITIN了。
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