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新手求教:怎样把小于30bp的DNA fragment 连接到vector上

新手求教:怎样把小于30bp的DNA fragment 连接到vector上# Biology - 生物学

I*y2010-05-16 07:05

1 楼

对于新实验室来讲，本着节约和对人认真负责的原则，是招俩technicians还是招俩pos
tdocs干活比较好？因为是rookie，怕对postdocs以后的career没啥大帮助，大家怎么看
？technician的工资待遇比postdocs开销大还是小？

s*n2010-05-16 07:05

2 楼

我09年到美国,J1 visa,一直呆到10年6月回国。然后同年8月再次来美国，F1 visa.，
一直呆到现在,还是F1visa在学校念PhD. 从2014年开始，应该按resident alien for
tax purpose报税。
2014暑假实习的时候，公司没有扣fica tax。请问我应该交fica tax吗？主要是因为我
还是学生身份，感觉不用交。谢谢解答。

I*y2010-05-16 07:05

3 楼

h1b转f1申请三个月前提交的,现在uscis还在"initial review"中
学校２周后开学,没有f1不让注册，h1b已经不valid了
学校不接受夏天入学，如果交新的I-20，新的入学时间是９月份，离现在太久，容易被
uscis reject
怎么办
多谢

r*g2010-05-16 07:05

4 楼

虽然上周已经疯传她要主动辞职，但是好像当事人和HR都没出声。然后今天下午她跑来
我办公室说她下午就走了，是最后一天，还是大吃一惊。因为她也算是新人，在公司才
干了10个月，我来的时候，她还带我四处走了一下。
然后她说，她在这个公司干得很不开心，本来想呆上一年，但是现在已经10个月，一刻
都不能呆下去，所以就主动辞职了。她的主动辞职算是公司里的新闻，因为公司的人员
很稳定，基本都是干很长时间的，走的都很多是因为其他原因，比如结婚回家等。还没
有一个像她这样主动辞职。而且时间很快，就是7月5日回来，她就提出辞职了。
然后她说，她出来就单干，现在手头已经有一单了。而且现在很多人给她电话，愿意给
她活。现在经济不好，所以公司现在都不愿意请全职的，而是宁愿请consultant,完成一单是一单。所以她看好自己的发展。
觉得挺佩服她的，有决心的而且有干劲。觉得自己也该多准备，多努力一下，要不温水煮青蛙，自己越来越没有勇气出来。现在公司福利虽好，工作稳定，但有时也挺无奈，就是工作效率低和水平不高，很多时间都用在推托上了。

c*e2010-05-16 07:05

5 楼

【以下文字转载自 Joke 讨论区】
发信人: mssql (没有potential), 信区: Joke
标题: 幼齿妹子叫了pizza外卖，结果...
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Apr 16 13:34:06 2012, 美东)
服务真不错的说

t*a2010-05-16 07:05

6 楼

第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

c*r2010-05-16 07:05

7 楼

两端加上酶切位点,最多长20bp, PCR 产物在50bp左右,这么小的片段好连接吗?
还有其他方法吗? 谢谢!

p*m2010-05-16 07:05

8 楼

书记你在哪儿faculty?

pos
么看

【在 I*****y 的大作中提到】

: 对于新实验室来讲，本着节约和对人认真负责的原则，是招俩technicians还是招俩pos
: tdocs干活比较好？因为是rookie，怕对postdocs以后的career没啥大帮助，大家怎么看
: ？technician的工资待遇比postdocs开销大还是小？

f*n2010-05-16 07:05

9 楼

应该交，除非在校内工作

d*12010-05-16 07:05

10 楼

SAS?

【在 r********g 的大作中提到】

: 虽然上周已经疯传她要主动辞职，但是好像当事人和HR都没出声。然后今天下午她跑来
: 我办公室说她下午就走了，是最后一天，还是大吃一惊。因为她也算是新人，在公司才
: 干了10个月，我来的时候，她还带我四处走了一下。
: 然后她说，她在这个公司干得很不开心，本来想呆上一年，但是现在已经10个月，一刻
: 都不能呆下去，所以就主动辞职了。她的主动辞职算是公司里的新闻，因为公司的人员
: 很稳定，基本都是干很长时间的，走的都很多是因为其他原因，比如结婚回家等。还没
: 有一个像她这样主动辞职。而且时间很快，就是7月5日回来，她就提出辞职了。
: 然后她说，她出来就单干，现在手头已经有一单了。而且现在很多人给她电话，愿意给
: 她活。现在经济不好，所以公司现在都不愿意请全职的，而是宁愿请consultant,完成一单是一单。所以她看好自己的发展。
: 觉得挺佩服她的，有决心的而且有干劲。觉得自己也该多准备，多努力一下，要不温水煮青蛙，自己越来越没有勇气出来。现在公司福利虽好，工作稳定，但有时也挺无奈，就是工作效率低和水平不高，很多时间都用在推托上了。

t*g2010-05-16 07:05

11 楼

饿啊

【在 c********e 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 Joke 讨论区】
: 发信人: mssql (没有potential), 信区: Joke
: 标题: 幼齿妹子叫了pizza外卖，结果...
: 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Apr 16 13:34:06 2012, 美东)
: 服务真不错的说

y*52010-05-16 07:05

12 楼

哈哈，抓起一个就塞进嘴~~管它卖相不卖相~~

【在 t**a 的大作中提到】

: 第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

b*k2010-05-16 07:05

13 楼

好像直接合成oligo，然后anneal，再链接就行。不过我也没有具体干过。我看的文章也
没有具体说怎么样anneal的。。。。

【在 c*********r 的大作中提到】

: 两端加上酶切位点,最多长20bp, PCR 产物在50bp左右,这么小的片段好连接吗?
: 还有其他方法吗? 谢谢!

f*r2010-05-16 07:05

14 楼

我自己所在实验室的感觉是，我觉得technician一般都是实验室的事情
当作一份工作，每天8小时，准时下班，不会愿意做太难或者有research性质的事情，如
果是博后，一般都会希望build以后的career，我觉得人品不错的博后肯定比大部分的t
echnician强。
我们实验室的technician一遇到问题就想办法回避，编出一堆理由和老板说做不出来什
么的，老板又很nice也说不了什么。
当然这个只是我自己实验室的感觉，可能不准，一家之言。

pos
么看

【在 I*****y 的大作中提到】

s*n2010-05-16 07:05

15 楼

我参考了一个tax tutorial, https://www.dropbox.com/s/gq4kdylagkanbcp/
international_tax_issues.pdf?dl=0
第5页domestic student fica exemption这一部分。
“ After the first 5 calendar years F-1 and J-1 students will become RA-TP
but may still be exempt from FICA, as long as they remain in bona fide
student status. This exemption is called the Domestic Student FICA Exemption
.”
还是做最坏的打算。因为公司没有扣，如果补交的话应该怎么交呢？

【在 f*******n 的大作中提到】

: 应该交，除非在校内工作

g*g2010-05-16 07:05

16 楼

做什么的？

成一单是一单。所以她看好自己的发展。
水煮青蛙，自己越来越没有勇气出来。现在公司福利虽好，工作稳定，但有时也挺无
奈，就是工作效率低和水平不高，很多时间都用在推托上了。

【在 r********g 的大作中提到】

K*a2010-05-16 07:05

17 楼

你看懂了么

【在 t****g 的大作中提到】

: 饿啊

T*e2010-05-16 07:05

18 楼

很赞
我很喜欢吃南瓜饼
看着这个南瓜包，就联想起南瓜饼了

【在 t**a 的大作中提到】

: 第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

l*s2010-05-16 07:05

19 楼

not difficult.

s*y2010-05-16 07:05

20 楼

啊呀，你居然不声不响的偷偷的就发考题了？恭喜恭喜。到什么地方去了？
以后准备做啥？
我是准备tachnician 和postdoc都各招一个。
其实要花的钱都差不多。但是各有各的用处。

pos
么看

【在 I*****y 的大作中提到】

f*n2010-05-16 07:05

21 楼

对啊，要在校内工作才行

Exemption

【在 s********n 的大作中提到】

: 我参考了一个tax tutorial, https://www.dropbox.com/s/gq4kdylagkanbcp/
: international_tax_issues.pdf?dl=0
: 第5页domestic student fica exemption这一部分。
: “ After the first 5 calendar years F-1 and J-1 students will become RA-TP
: but may still be exempt from FICA, as long as they remain in bona fide
: student status. This exemption is called the Domestic Student FICA Exemption
: .”
: 还是做最坏的打算。因为公司没有扣，如果补交的话应该怎么交呢？

s*t2010-05-16 07:05

22 楼

COASK

t*g2010-05-16 07:05

23 楼

抹油

【在 K*a 的大作中提到】

: 你看懂了么

D*62010-05-16 07:05

24 楼

瓦，这么美的包子和桌子！
这南瓜包是说样子象还是馅里也有南瓜？

【在 t**a 的大作中提到】

: 第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

n*d2010-05-16 07:05

25 楼

合成末端磷酸化的互补oligo，然后在TE中变性复性，用T4 ligase连接，oligo记得过
量加
长出来的clone基本都是，不过最好在合成的oligo中设好合适的酶切位点

章也

【在 b******k 的大作中提到】

: 好像直接合成oligo，然后anneal，再链接就行。不过我也没有具体干过。我看的文章也
: 没有具体说怎么样anneal的。。。。

p*m2010-05-16 07:05

26 楼

tech你准备让他做啥呢？我都有点不知道怎么安排tech的活儿还是postdoc省心哈。。

【在 s******y 的大作中提到】

: 啊呀，你居然不声不响的偷偷的就发考题了？恭喜恭喜。到什么地方去了？
: 以后准备做啥？
: 我是准备tachnician 和postdoc都各招一个。
: 其实要花的钱都差不多。但是各有各的用处。
:
: pos
: 么看

s*n2010-05-16 07:05

27 楼

能补吗。。？

【在 f*******n 的大作中提到】

: 对啊，要在校内工作才行
:
: Exemption

t*n2010-05-16 07:05

28 楼

【在 s*******t 的大作中提到】

: COASK

K*a2010-05-16 07:05

29 楼

就知道

【在 t****g 的大作中提到】

: 抹油

y*52010-05-16 07:05

30 楼

这个包，就是南瓜打碎了弄成这个形状的吧？！
期待答案，以及包子，呵呵

【在 D******6 的大作中提到】

: 瓦，这么美的包子和桌子！
: 这南瓜包是说样子象还是馅里也有南瓜？

b*k2010-05-16 07:05

31 楼

这个正是太巧了。我也想问这个问题的。可否再详细一点？
oligo默认都是末端Pi的吧？
怎么在TE中变性复兴？oligo的浓度、反应的时间？和载体的比例，连接时？
过量加长？
谢谢

【在 n******d 的大作中提到】

: 合成末端磷酸化的互补oligo，然后在TE中变性复性，用T4 ligase连接，oligo记得过
: 量加
: 长出来的clone基本都是，不过最好在合成的oligo中设好合适的酶切位点
:
: 章也

s*y2010-05-16 07:05

32 楼

很多杂七杂八的项目可以让他做啊! 还有一些什么genotyping, histological
analysis，house keeping (prepare pipet, make medium and buffer)等等，
因为这些都是比较labor intense 但是又没有什么意思的常规事情，
一般博士后让他们做这些可能会抱怨的。

【在 p*****m 的大作中提到】

: tech你准备让他做啥呢？我都有点不知道怎么安排tech的活儿还是postdoc省心哈。。

f*n2010-05-16 07:05

33 楼

扣是公司的责任。你无法补；只有公司可以补，跟着再扣你的。你可以提醒公司。但是
最后为这个负责的是公司。

【在 s********n 的大作中提到】

: 能补吗。。？

E*s2010-05-16 07:05

34 楼

看成“白女--主动--干”。都是block reading惹的祸。

t*g2010-05-16 07:05

35 楼

等你这句话

【在 K*a 的大作中提到】

: 就知道

D*62010-05-16 07:05

36 楼

奥，还有这么做的。。。打碎了团成包子的样子蒸熟吃？

【在 y******5 的大作中提到】

: 这个包，就是南瓜打碎了弄成这个形状的吧？！
: 期待答案，以及包子，呵呵

l*s2010-05-16 07:05

37 楼

Nay, the 5-prime end of synthesized oligos is normally hydroxy group, you
need to order additional modification.
For annealing, water is also OK.Just throw oligo solutions in boiled water
and let it cool naturally.

【在 b******k 的大作中提到】

: 这个正是太巧了。我也想问这个问题的。可否再详细一点？
: oligo默认都是末端Pi的吧？
: 怎么在TE中变性复兴？oligo的浓度、反应的时间？和载体的比例，连接时？
: 过量加长？
: 谢谢

p*m2010-05-16 07:05

38 楼

光常规的事一个tech干有点浪费哈。。你像配溶液灭菌genotyping这种事我们现在整个
大lab才一个tech干一个3-4人的小Lab就用一个稍微有点多。。我有次面试一个
faculty建议弄几个本科生 work-study那种来干很便宜也放心我觉得这个主意挺好的
。。

【在 s******y 的大作中提到】

: 很多杂七杂八的项目可以让他做啊! 还有一些什么genotyping, histological
: analysis，house keeping (prepare pipet, make medium and buffer)等等，
: 因为这些都是比较labor intense 但是又没有什么意思的常规事情，
: 一般博士后让他们做这些可能会抱怨的。

s*n2010-05-16 07:05

39 楼

知道利弊了。谢谢这么详细的解答。

【在 f*******n 的大作中提到】

: 扣是公司的责任。你无法补；只有公司可以补，跟着再扣你的。你可以提醒公司。但是
: 最后为这个负责的是公司。

a*82010-05-16 07:05

40 楼

本来挺美好一事儿。。。

【在 E**s 的大作中提到】

: 看成“白女--主动--干”。都是block reading惹的祸。

k*n2010-05-16 07:05

41 楼

下次要求画点儿别的。。。。或者贴张照片

【在 c********e 的大作中提到】

y*52010-05-16 07:05

42 楼

我猜的呀，你看那个形状像压出来的，不是包出来的褶子
呵呵，不保证猜的准确性

【在 D******6 的大作中提到】

: 奥，还有这么做的。。。打碎了团成包子的样子蒸熟吃？

a*e2010-05-16 07:05

43 楼

when u order oligo, the end is -OH, you have to kinase first by T4 PNK.
you can kinase (+) & (-) strands together in 50 ul volumn. then boil it
in water, let the water cool down on bench gradulately.
then it is enought for ligation.

【在 b******k 的大作中提到】

s*y2010-05-16 07:05

44 楼

当然不会就光让他配溶液的，我已经定好的技术员是能做实验的，和一个RAP
差不多，甚至能帮我教博士后一些基础技术那种。
用本科生配常规溶液是个好主意。不过我在医学院，和主校区有点小距离，
本科生不一定乐意来呢。
我得问问我将来的同事们怎么处理这个事情。

【在 p*****m 的大作中提到】

: 光常规的事一个tech干有点浪费哈。。你像配溶液灭菌genotyping这种事我们现在整个
: 大lab才一个tech干一个3-4人的小Lab就用一个稍微有点多。。我有次面试一个
: faculty建议弄几个本科生 work-study那种来干很便宜也放心我觉得这个主意挺好的
: 。。

b*z2010-05-16 07:05

45 楼

发

Y*e2010-05-16 07:05

46 楼

haha,funny
还有这女生有点像郑少秋女儿

b*72010-05-16 07:05

47 楼

wow 居然碰到有我知道的，通常我做出来的都是添不饱肚子 sigh
这个是南瓜蒸熟了，碎了和糯米粉混合，再捏成小南瓜形状
里面通常添上豆沙馅，芝麻馅，嘿嘿或者 taro 馅
我看上了你家蒸笼里的叶子了，那是什么？

【在 t**a 的大作中提到】

: 第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

b*k2010-05-16 07:05

48 楼

so, if i am going to ligate two tandem short fragments (say, 50bp each):
synthesize 50nt oligo of Sense and antisense (with 5' phosphate group modifi
cation),
anneal them by boiling and cooling naturally,
then ligate the annealed fragments (ideally, with synthesizd 3' overhang fro
m first one, and 5' overhang from 2nd)by conventional T4 ligase system?
thanks.

【在 l*********s 的大作中提到】

: Nay, the 5-prime end of synthesized oligos is normally hydroxy group, you
: need to order additional modification.
: For annealing, water is also OK.Just throw oligo solutions in boiled water
: and let it cool naturally.
:

p*m2010-05-16 07:05

49 楼

医学院就不好弄小本了。。话说你的tech是怎么招来的？

【在 s******y 的大作中提到】

: 当然不会就光让他配溶液的，我已经定好的技术员是能做实验的，和一个RAP
: 差不多，甚至能帮我教博士后一些基础技术那种。
: 用本科生配常规溶液是个好主意。不过我在医学院，和主校区有点小距离，
: 本科生不一定乐意来呢。
: 我得问问我将来的同事们怎么处理这个事情。

d*t2010-05-16 07:05

50 楼

很多人都是这样开始自己的事业的，真的是无可奈何才愿意一辈子为别人打工

t*g2010-05-16 07:05

51 楼

把你的贴上

【在 k****n 的大作中提到】

: 下次要求画点儿别的。。。。或者贴张照片

D*62010-05-16 07:05

52 楼

听上去很好吃！
这是甜的呢还是咸的呢？
那个南瓜上顶的尖是什么？南瓜是好吃，就是随便炒炒吃也很好吃。

【在 b*****7 的大作中提到】

: wow 居然碰到有我知道的，通常我做出来的都是添不饱肚子 sigh
: 这个是南瓜蒸熟了，碎了和糯米粉混合，再捏成小南瓜形状
: 里面通常添上豆沙馅，芝麻馅，嘿嘿或者 taro 馅
: 我看上了你家蒸笼里的叶子了，那是什么？

b*k2010-05-16 07:05

53 楼

T4 pnk:
Catalyzes the transfer and exchange of Pi from the γ position of ATP to
the 5 -hydroxyl terminus of polynucleotides (double-and single-stranded
DNA and RNA) and nucleoside 3-monophosphates. Polynucleotide Kinase also
catalyzes the removal of 3-phosphoryl groups from 3-phosphoryl
polynucleotides, deoxynucleoside 3-monophosphates and deoxynucleoside 3
-diphosphates (1).
Thanks a lot.
sounds like I need to go over some basic, get confused....

【在 a***e 的大作中提到】

: when u order oligo, the end is -OH, you have to kinase first by T4 PNK.
: you can kinase (+) & (-) strands together in 50 ul volumn. then boil it
: in water, let the water cool down on bench gradulately.
: then it is enought for ligation.

s*y2010-05-16 07:05

54 楼

我本来就认识他。正好他老板没有钱养他了。
所以我就顺手牵羊了。

【在 p*****m 的大作中提到】

: 医学院就不好弄小本了。。话说你的tech是怎么招来的？

h*a2010-05-16 07:05

55 楼

佩服！
盼望自己出来干！

p*e2010-05-16 07:05

56 楼

赞，口水，用包子来换个吃吃，呵呵

【在 t**a 的大作中提到】

: 第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

c*r2010-05-16 07:05

57 楼

Thanks a lot!
Do I need to purificate the product of anneal before ligation?

p*m2010-05-16 07:05

58 楼

bucuo..Chinese?

【在 s******y 的大作中提到】

: 我本来就认识他。正好他老板没有钱养他了。
: 所以我就顺手牵羊了。

r*32010-05-16 07:05

59 楼

这很正常。要是没有身份的困扰，自己单干爽得多。毕竟，美国这边商业规则正轨一些。

成一单是一单。所以她看好自己的发展。
水煮青蛙，自己越来越没有勇气出来。现在公司福利虽好，工作稳定，但有时也挺无
奈，就是工作效率低和水平不高，很多时间都用在推托上了。

【在 r********g 的大作中提到】

b*72010-05-16 07:05

60 楼

一般都是甜的馅，所以是茶点了
顶上的蒂可以充分发挥你的创造力：葡萄干，香菜叶，巧克力
蒸好后再加上。
包成小饼的形状，用西餐刀背轻轻按出褶皱的

【在 D******6 的大作中提到】

: 听上去很好吃！
: 这是甜的呢还是咸的呢？
: 那个南瓜上顶的尖是什么？南瓜是好吃，就是随便炒炒吃也很好吃。

g*52010-05-16 07:05

61 楼

design a long primer and use quikchange kit do insert mutation.

T*e2010-05-16 07:05

62 楼

你行啊，居然还会做这个？

【在 b*****7 的大作中提到】

i*a2010-05-16 07:05

63 楼

n多年前做过，应该挺简单的
若是30bp的话
___________________
_____________________
如上图一样设计引物，中间15-20个碱基配对，两端再加上6个碱基的内切酶位点，再各
加3-4个保护碱基
正常PCR后，电泳，纯化，测浓度，各自酶切，失活，酒精沉淀，再溶，然后用T4连接酶连接
clony PCR的时候可以用primer之一跟vector上附近的一个primer试试看

b*72010-05-16 07:05

64 楼

汗，我做完后吃完后都还得下面条添肚子的

【在 T*********e 的大作中提到】

: 你行啊，居然还会做这个？

i*a2010-05-16 07:05

65 楼

PCR的时候不需要底物，加设计好的两条引物就Ok了

T*e2010-05-16 07:05

66 楼

好吃就行
啥时候做点给我们大家品尝一下

【在 b*****7 的大作中提到】

: 汗，我做完后吃完后都还得下面条添肚子的

h*92010-05-16 07:05

67 楼

干过此事。很容易。从95度起设几个梯度用PCR仪逐渐降温即可。

章也

【在 b******k 的大作中提到】

: 好像直接合成oligo，然后anneal，再链接就行。不过我也没有具体干过。我看的文章也
: 没有具体说怎么样anneal的。。。。

j*j2010-05-16 07:05

68 楼

赞，都很能干。

【在 b*****7 的大作中提到】

: 一般都是甜的馅，所以是茶点了
: 顶上的蒂可以充分发挥你的创造力：葡萄干，香菜叶，巧克力
: 蒸好后再加上。
: 包成小饼的形状，用西餐刀背轻轻按出褶皱的

x*e2010-05-16 07:05

69 楼

贴个我的做法吧，成功率很高，供参考。
1、引物退火溶液Annealing buffer: NaCl 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7.4
(1ml: NaCl 2M 50ul, HEPES 1M 50ul, 加水至1 ml，pH试纸调pH)
2、引物浓度约=28.3ug/OD, 加入94ul Annealing Buffer 至终浓度 0.3 mg/ml
3、加入上下游引物各10 ul，Annealing Buffer 30 ul，90度4分钟，70度10分钟，然
后放到500 ml装有70度热水的烧杯中，室温冷却后连接或-20度保存。
4、连接质粒，加入2ul退火后的产物，1 ul T4 DNA ligase buffer, 1ul pSR/BglII+
HindIII 线性质粒, 5 ul 水，1 ul T4 Ligase. 连接（16度过夜或室温30－120分钟）。
5、加入1 ul Bgl II 至连接产物中，37度消化30分钟，转化感受态细胞。
6、挑取转换子，提质粒，酶切鉴定，注意阴性克隆切出条带大概1kb（227，248和
281bp条带差异不明显，故对

【在 h*****9 的大作中提到】

: 干过此事。很容易。从95度起设几个梯度用PCR仪逐渐降温即可。
:
: 章也

uq2010-05-16 07:05

70 楼

赞，真有情调

【在 t**a 的大作中提到】

: 第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

s*n2010-05-16 07:05

71 楼

设计oligo的时候可以把粘性末端设计好，链接前可以不用做酶切。
我试过的一个protocol，非常简单好用：
1. oligos用TE or H2O溶解，浓度100 uM；
2. 磷酸化准备如下，37C一个小时, 70C for 10 min.
15 ul H2O + 2 ul oligo (100 uM) + 2 ul T4 ligase buffer + 1 ul TNK
3. 退火反应如下，95C 5 min in PCR cycler，RT for 30 min.
18 ul H2O + 1 ul oligo F + 1 ul oligo R (final 0.5 uM fragment)
这个产物可以直接用于连接。

t*a2010-05-16 07:05

72 楼

第二锅明显好多了

【在 t**a 的大作中提到】

: 第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

c*r2010-05-16 07:05

73 楼

谢谢smartkevin 奉献简单的protocol!

【在 s********n 的大作中提到】

: 设计oligo的时候可以把粘性末端设计好，链接前可以不用做酶切。
: 我试过的一个protocol，非常简单好用：
: 1. oligos用TE or H2O溶解，浓度100 uM；
: 2. 磷酸化准备如下，37C一个小时, 70C for 10 min.
: 15 ul H2O + 2 ul oligo (100 uM) + 2 ul T4 ligase buffer + 1 ul TNK
: 3. 退火反应如下，95C 5 min in PCR cycler，RT for 30 min.
: 18 ul H2O + 1 ul oligo F + 1 ul oligo R (final 0.5 uM fragment)
: 这个产物可以直接用于连接。

t*a2010-05-16 07:05

74 楼

来个全家福

【在 t**a 的大作中提到】

: 第二锅明显好多了

c*r2010-05-16 07:05

75 楼

很具体! 谢谢!

）。

【在 x*****e 的大作中提到】

: 贴个我的做法吧，成功率很高，供参考。
: 1、引物退火溶液Annealing buffer: NaCl 100 mM, Hepes 50 mM, pH 7.4
: (1ml: NaCl 2M 50ul, HEPES 1M 50ul, 加水至1 ml，pH试纸调pH)
: 2、引物浓度约=28.3ug/OD, 加入94ul Annealing Buffer 至终浓度 0.3 mg/ml
: 3、加入上下游引物各10 ul，Annealing Buffer 30 ul，90度4分钟，70度10分钟，然
: 后放到500 ml装有70度热水的烧杯中，室温冷却后连接或-20度保存。
: 4、连接质粒，加入2ul退火后的产物，1 ul T4 DNA ligase buffer, 1ul pSR/BglII+
: HindIII 线性质粒, 5 ul 水，1 ul T4 Ligase. 连接（16度过夜或室温30－120分钟）。
: 5、加入1 ul Bgl II 至连接产物中，37度消化30分钟，转化感受态细胞。
: 6、挑取转换子，提质粒，酶切鉴定，注意阴性克隆切出条带大概1kb（227，248和

t*a2010-05-16 07:05

76 楼

其实这个也没有陷，叫南瓜包并不恰当，不过又不是南瓜饼，该取个什么名字呢？想想
。。

【在 T*********e 的大作中提到】

: 很赞
: 我很喜欢吃南瓜饼
: 看着这个南瓜包，就联想起南瓜饼了

g*52010-05-16 07:05

77 楼

I think mutation is the easiest way to do. just with quikchange kit, about
200 bucks.
because your pcr fragment is smaller than 30 bp, so you could design primer
with this sequence and flanked with vector sequence, 15 bp each, then use
this 60 bp primer pair do insert mutation, just one PCR and transform.
good luck

uq2010-05-16 07:05

78 楼

这怎么还在蒸呢@@
没吃饭的飘过。。

【在 t**a 的大作中提到】

: 第二锅明显好多了

X*n2010-05-16 07:05

79 楼

我的做法是：
1. Linearize plasmid with restriction enzymes.
2. 1 uM sense and antisense strand in Qiagen EB buffer, 95oC 5min, turn off PCR machine directly.After half an hour chill it on ice.
3. 10-100 ng linearized plasmid plus 1 uL 1 uM annealed insert, 5 uL fast ligation system, RT. 10 min.
4. Transform DH5alpha competent cell.
I don't think you need to phosphorylation of the insert.It works for me.

【在 c*********r 的大作中提到】

: 很具体! 谢谢!
:
: ）。

D*62010-05-16 07:05

80 楼

个头均匀了。

【在 t**a 的大作中提到】

: 第二锅明显好多了

b*k2010-05-16 07:05

81 楼

3'prime of oligo is default hydroxy group,right? not 5'prime.
why do we need to add 3 prime Pi to the oligo before annealling?
thanks.

【在 l*********s 的大作中提到】

t*a2010-05-16 07:05

82 楼

是用南瓜泥做，又做的有一点南瓜的样子。
不过因为很小，所以没包陷。

【在 D******6 的大作中提到】

: 瓦，这么美的包子和桌子！
: 这南瓜包是说样子象还是馅里也有南瓜？

t*a2010-05-16 07:05

83 楼

悠悠果然聪明
南瓜泥，麦粉，因为喜欢coconut味道，所以加了点椰丝
因为不是没陷，不是包子，悠悠给想个名字吧

【在 y******5 的大作中提到】

: 这个包，就是南瓜打碎了弄成这个形状的吧？！
: 期待答案，以及包子，呵呵

t*a2010-05-16 07:05

84 楼

连这个都被你看出来了，太厉害了
小南瓜的柄是葡萄干做的，不过不是在蒸好后，是蒸前加上去的

【在 b*****7 的大作中提到】

: 汗，我做完后吃完后都还得下面条添肚子的

t*a2010-05-16 07:05

85 楼

谢谢，包子吃到，味道好极了

【在 p******e 的大作中提到】

: 赞，口水，用包子来换个吃吃，呵呵

t*a2010-05-16 07:05

86 楼

哈哈，想做这个已经好久了，那个南瓜买来放冰箱里也都三个月了。今天刚好有空了。

【在 uq 的大作中提到】

: 赞，真有情调

t*a2010-05-16 07:05

87 楼

这不下午一直在地震么，太耽误时间了。

【在 uq 的大作中提到】

: 这怎么还在蒸呢@@
: 没吃饭的飘过。。

t*a2010-05-16 07:05

88 楼

现在可以休息一下拉，呼呼

b*72010-05-16 07:05

89 楼

难怪，下午觉得吊灯一直在晃的，不过自己没感觉到什么

【在 t**a 的大作中提到】

: 这不下午一直在地震么，太耽误时间了。

b*72010-05-16 07:05

90 楼

嗯，懒人菜谱大家的通爱
刚才你不在，我在帮你瞎答的，见谅啊
那个大叶子难道是棕叶吗？

【在 t**a 的大作中提到】

: 连这个都被你看出来了，太厉害了
: 小南瓜的柄是葡萄干做的，不过不是在蒸好后，是蒸前加上去的

uq2010-05-16 07:05

91 楼

。。。
又震了？
不过通过小震释放能量多，就不需要大震了

【在 t**a 的大作中提到】

: 这不下午一直在地震么，太耽误时间了。

uq2010-05-16 07:05

92 楼

真正的懒人是俺们只知道吃不会做的，呵呵

【在 b*****7 的大作中提到】

: 嗯，懒人菜谱大家的通爱
: 刚才你不在，我在帮你瞎答的，见谅啊
: 那个大叶子难道是棕叶吗？

T*e2010-05-16 07:05

93 楼

形状像南瓜灯
不如叫灯笼糕好了

【在 t**a 的大作中提到】

: 连这个都被你看出来了，太厉害了
: 小南瓜的柄是葡萄干做的，不过不是在蒸好后，是蒸前加上去的

T*e2010-05-16 07:05

94 楼

你好迟钝，哈哈

【在 b*****7 的大作中提到】

: 难怪，下午觉得吊灯一直在晃的，不过自己没感觉到什么

T*e2010-05-16 07:05

95 楼

已经有人论证过这种想法很幼稚了
要想通过小地震释放大地震的能量，需要上百万次小地震甚至更多才行。。。

【在 uq 的大作中提到】

: 。。。
: 又震了？
: 不过通过小震释放能量多，就不需要大震了

t*a2010-05-16 07:05

96 楼

嗯，是粽子叶。刚好昨天朋友作了素粽子，今天中午吃了一个，家里找不到其他新鲜的
叶子了，就废物利用了一下。赫赫。如果有新鲜的叶子估计为到会更好些
要谢谢mm帮我回答呢。

【在 b*****7 的大作中提到】

: 嗯，懒人菜谱大家的通爱
: 刚才你不在，我在帮你瞎答的，见谅啊
: 那个大叶子难道是棕叶吗？

p*e2010-05-16 07:05

97 楼

我这里一整天都在刮风，跟地震的感觉也差不多，只是晃动的频率低。

【在 b*****7 的大作中提到】

: 难怪，下午觉得吊灯一直在晃的，不过自己没感觉到什么

p*e2010-05-16 07:05

98 楼

南瓜到底该怎么做呢？
我只吃过3次，一次是小时候同学送的，我妈就胡乱蒸了一下，我们挖着吃了几口，都
不喜欢，又甜又腻，味道很怪；
第二次，是去串门，人家刚买了个南瓜派，给我切了一丫，好大的牛油味啊，我居然硬
着头皮都吃下去了；
还有一次是去年，家里聚餐，一个朋友带了一个南瓜盅，看得出她费了很多精神做的，
但是味道实在很一般。
去年秋天还搞了2个小南瓜，绿皮的，一直不知道怎么吃，最终烂掉了，真可惜。
看tara的这个南瓜糕，好像很美味的样子，又想试试。

S*f2010-05-16 07:05

99 楼

又震了？
怎么我有点唯恐天下不乱的兴奋。。

【在 T*********e 的大作中提到】

: 你好迟钝，哈哈

T*e2010-05-16 07:05

100 楼

美国墨西哥边境，7.2级
离LA不到200迈
据说这次持续时间挺长

【在 S*********f 的大作中提到】

: 又震了？
: 怎么我有点唯恐天下不乱的兴奋。。

S*f2010-05-16 07:05

101 楼

逃离la了该

【在 T*********e 的大作中提到】

: 美国墨西哥边境，7.2级
: 离LA不到200迈
: 据说这次持续时间挺长

T*e2010-05-16 07:05

102 楼

阅
转某人执行

【在 S*********f 的大作中提到】

: 逃离la了该

S*f2010-05-16 07:05

103 楼

haha
不过la真大地震可能伤亡也很小，都木头房子

【在 T*********e 的大作中提到】

: 阅
: 转某人执行

T*e2010-05-16 07:05

104 楼

不一定
木头房子一样砸死人
不过，我觉得现在LA人民最惨的是生活在惊吓中

【在 S*********f 的大作中提到】

: haha
: 不过la真大地震可能伤亡也很小，都木头房子

S*f2010-05-16 07:05

105 楼

心里素质一定要好，每天饭前默念三遍生死有命

【在 T*********e 的大作中提到】

: 不一定
: 木头房子一样砸死人
: 不过，我觉得现在LA人民最惨的是生活在惊吓中

T*e2010-05-16 07:05

106 楼

和我一样？

【在 S*********f 的大作中提到】

: 心里素质一定要好，每天饭前默念三遍生死有命

S*f2010-05-16 07:05

107 楼

和我一样

【在 T*********e 的大作中提到】

: 和我一样？

T*e2010-05-16 07:05

108 楼

你每天吃饭之前还祷告？

【在 S*********f 的大作中提到】

: 和我一样

t*a2010-05-16 07:05

109 楼

好名字，就是它了

【在 T*********e 的大作中提到】

: 形状像南瓜灯
: 不如叫灯笼糕好了

S*f2010-05-16 07:05

110 楼

我要默念中大奖吧中大奖吧才叫祷告不。。

【在 T*********e 的大作中提到】

: 你每天吃饭之前还祷告？

T*e2010-05-16 07:05

111 楼

好吧
我一般不默念这个，因为知道中不了奖

【在 S*********f 的大作中提到】

: 我要默念中大奖吧中大奖吧才叫祷告不。。

l*e2010-05-16 07:05

112 楼

真好看的小南瓜

【在 t**a 的大作中提到】

: 第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

l*e2010-05-16 07:05

113 楼

嘿嘿
借lz的贴的光我也来献丑一下~~~
俺的chocolate chip cookie.....卖相也是很难看，但吃起来还算爽口。。。

【在 t**a 的大作中提到】

: 第一次做，卖相不太好，不过味道还不错。

uq2010-05-16 07:05

114 楼

論證自己幼稚？。。
用綫性思維探討複雜體系是個不錯的開端
不過地震這個課題還是有很多需要研究

【在 T*********e 的大作中提到】

: 已经有人论证过这种想法很幼稚了
: 要想通过小地震释放大地震的能量，需要上百万次小地震甚至更多才行。。。