wy
2 楼
作者是在读大学生吧，如果不是高中生的话
t*q
3 楼
RT. I want to know.
j*i
4 楼
做一个EKR1/2底物磷酸化的实验，用ERK1/2抑制剂发现磷酸化被block掉.
但是32-ATP体外磷酸化做了两次，都没信号。
磷酸化实验没问题，因为positive control可以被phos-ERK2磷酸化。
有没有可能ERK不是上游直接Kinase?
不知道那位有好的idea?
但是32-ATP体外磷酸化做了两次，都没信号。
磷酸化实验没问题，因为positive control可以被phos-ERK2磷酸化。
有没有可能ERK不是上游直接Kinase?
不知道那位有好的idea?
M*L
5 楼
If they want you, they will try hard to contact you.
Just be patient! Bless!
Just be patient! Bless!
T*c
6 楼
可能差不多，少年宅
【在 wy 的大作中提到】
: 作者是在读大学生吧，如果不是高中生的话
【在 wy 的大作中提到】
: 作者是在读大学生吧，如果不是高中生的话
n*w
7 楼
Haskell
【在 t***q 的大作中提到】
: RT. I want to know.
【在 t***q 的大作中提到】
: RT. I want to know.
h*y
8 楼
我做过一个实验，不是MAPK，用的是MAP2K，
发现在in vitro kinase的条件下，MAP2K自己就可以autophosphorylation，我猜想
MAPK应该也会是类似的情况，毕竟体外的实验总是有一些artifact。另外，看早期的
MAPK的paper，他们的in vitro kinase assay是不需要加入MAP2K的。当然加入MAP2K之
后，对MAPK底物的磷酸化会强很多。
另外，你在你的kinase里面有没有加入DTT？我们发现某些kinase因为某些特定位置的
aa，对DTT是敏感的。而ERK在相应的位置恰好存在一个这样的aa
【在 j***i 的大作中提到】
: 做一个EKR1/2底物磷酸化的实验，用ERK1/2抑制剂发现磷酸化被block掉.
: 但是32-ATP体外磷酸化做了两次，都没信号。
: 磷酸化实验没问题，因为positive control可以被phos-ERK2磷酸化。
: 有没有可能ERK不是上游直接Kinase?
: 不知道那位有好的idea?
发现在in vitro kinase的条件下，MAP2K自己就可以autophosphorylation，我猜想
MAPK应该也会是类似的情况，毕竟体外的实验总是有一些artifact。另外，看早期的
MAPK的paper，他们的in vitro kinase assay是不需要加入MAP2K的。当然加入MAP2K之
后，对MAPK底物的磷酸化会强很多。
另外，你在你的kinase里面有没有加入DTT？我们发现某些kinase因为某些特定位置的
aa，对DTT是敏感的。而ERK在相应的位置恰好存在一个这样的aa
【在 j***i 的大作中提到】
: 做一个EKR1/2底物磷酸化的实验，用ERK1/2抑制剂发现磷酸化被block掉.
: 但是32-ATP体外磷酸化做了两次，都没信号。
: 磷酸化实验没问题，因为positive control可以被phos-ERK2磷酸化。
: 有没有可能ERK不是上游直接Kinase?
: 不知道那位有好的idea?
k*n
9 楼
那些科幻名词我都看得很晕。。。
唉。。年纪大了。。
唉。。年纪大了。。
j*i
10 楼
谢谢hanchenjammy的分享。
1）我用了1mM DTT在Kinase Buffer。这次我去掉DTT试试；
2）“当然加入MAP2K之后，对MAPK底物的磷酸化会强很多” EK293T中才纯化的ERK2,收
细胞前，用EGF刺激细胞，让EKR磷酸化，所以可以替代加MAP2K；
3）我发现分子量很小的一个位置（20Kd?），有信号，而对照点突变没有，可能是降解
产物。所以在想：是不是全长不容易被磷酸化？降解的反而暴露出位点？
有没有新的结果，给告详解。
1）我用了1mM DTT在Kinase Buffer。这次我去掉DTT试试；
2）“当然加入MAP2K之后，对MAPK底物的磷酸化会强很多” EK293T中才纯化的ERK2,收
细胞前，用EGF刺激细胞，让EKR磷酸化，所以可以替代加MAP2K；
3）我发现分子量很小的一个位置（20Kd?），有信号，而对照点突变没有，可能是降解
产物。所以在想：是不是全长不容易被磷酸化？降解的反而暴露出位点？
有没有新的结果，给告详解。
d*r
11 楼
青菜萝卜，青菜萝卜
俺比较小白，开头小白文，俺还能勉强当粮草，到了众人推崇的联网那块俺就跟不下去
了。。。
俺比较小白，开头小白文，俺还能勉强当粮草，到了众人推崇的联网那块俺就跟不下去
了。。。
j*i
12 楼
update my result.
其他的条件都没变，就重新纯化地物蛋白，把GST切除点，可以被磷酸化了。
可能GST对蛋白的结构有一定的影响。
再次感谢hanchenjammy 。
其他的条件都没变，就重新纯化地物蛋白，把GST切除点，可以被磷酸化了。
可能GST对蛋白的结构有一定的影响。
再次感谢hanchenjammy 。
s*s
13 楼
瞄了几章，实在看不下去
【在 wy 的大作中提到】
: 作者是在读大学生吧，如果不是高中生的话
【在 wy 的大作中提到】
: 作者是在读大学生吧，如果不是高中生的话
s*s
14 楼
good~
【在 j***i 的大作中提到】
: update my result.
: 其他的条件都没变，就重新纯化地物蛋白，把GST切除点，可以被磷酸化了。
: 可能GST对蛋白的结构有一定的影响。
: 再次感谢hanchenjammy 。
【在 j***i 的大作中提到】
: update my result.
: 其他的条件都没变，就重新纯化地物蛋白，把GST切除点，可以被磷酸化了。
: 可能GST对蛋白的结构有一定的影响。
: 再次感谢hanchenjammy 。
f*e
15 楼
可以试试跳到 法师的世界 那章，有点三体的感觉
h*y
16 楼
cong~~
【在 j***i 的大作中提到】
: update my result.
: 其他的条件都没变，就重新纯化地物蛋白，把GST切除点，可以被磷酸化了。
: 可能GST对蛋白的结构有一定的影响。
: 再次感谢hanchenjammy 。
【在 j***i 的大作中提到】
: update my result.
: 其他的条件都没变，就重新纯化地物蛋白，把GST切除点，可以被磷酸化了。
: 可能GST对蛋白的结构有一定的影响。
: 再次感谢hanchenjammy 。
s*m
17 楼
硬着头皮试了两次，实实在在是看不下去
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