V*R
2 楼
好像还挺普遍的，不知道是移民官水平有限还是怎么着。这种情况需要中途出境（加拿
大，墨西哥）一次，然后换一个I-94并叮嘱注意valid date是2年而不是一年吗？谢谢
大，墨西哥）一次，然后换一个I-94并叮嘱注意valid date是2年而不是一年吗？谢谢
w*i
3 楼
天线宝宝，能不能加一个湖南经视的幸福来敲门啊，一个中老年人的相亲节目，父母特
别的喜欢看。
谢谢
别的喜欢看。
谢谢
r*d
4 楼
问：藏传佛教、汉传佛教、南传佛教之间如何取长补短，以弥补各自的缺陷？
答：藏传佛教：向来对小乘、大乘、密乘三乘的戒律格外重视，但由于地理环境等因素
的限制，素食只为少数行者所受持。相比之下，汉传佛教的素食观实在很殊胜，自古以
来的素食传统，不知饶益了多少众生。若能学习这种慈悲为怀的素食观，则可减少现今
藏传佛教中的诸多过患。而与南传佛教相比，藏地许多活佛、大德的住处过于奢华。我
见过南传僧人的寮房，屋里除了法本和零星的生活用具以外，并无其他器物，整个房间
自然透露着一种知足少欲的修行气息，这些行为都值得我们借鉴和学习。
汉传佛教：虽有许多古代大德的论典与教言流传于世，也有许多寺院与佛学院，但像藏
传佛教这样系统闻思修佛法的道场却极为罕见。佛法的见修至关重要，如果缺乏对见解
和修行的次第引导，即使有修行之心，恐怕也难以找到入门之处。若能像藏传佛教这样
树立起闻思修的体系，出家人一生的修行就会很有把握。而与南传佛教相比，除了个别
律宗道场以外，很多地方的威仪似有欠缺。南传佛教中的托钵乞食在汉传佛教中实现，
恐怕有些困难，但除此之外的诸多威仪，如果能够借鉴，汉传僧人的形象会更引发人们
的信心
答：藏传佛教：向来对小乘、大乘、密乘三乘的戒律格外重视，但由于地理环境等因素
的限制，素食只为少数行者所受持。相比之下，汉传佛教的素食观实在很殊胜，自古以
来的素食传统，不知饶益了多少众生。若能学习这种慈悲为怀的素食观，则可减少现今
藏传佛教中的诸多过患。而与南传佛教相比，藏地许多活佛、大德的住处过于奢华。我
见过南传僧人的寮房，屋里除了法本和零星的生活用具以外，并无其他器物，整个房间
自然透露着一种知足少欲的修行气息，这些行为都值得我们借鉴和学习。
汉传佛教：虽有许多古代大德的论典与教言流传于世，也有许多寺院与佛学院，但像藏
传佛教这样系统闻思修佛法的道场却极为罕见。佛法的见修至关重要，如果缺乏对见解
和修行的次第引导，即使有修行之心，恐怕也难以找到入门之处。若能像藏传佛教这样
树立起闻思修的体系，出家人一生的修行就会很有把握。而与南传佛教相比，除了个别
律宗道场以外，很多地方的威仪似有欠缺。南传佛教中的托钵乞食在汉传佛教中实现，
恐怕有些困难，但除此之外的诸多威仪，如果能够借鉴，汉传僧人的形象会更引发人们
的信心
g*n
5 楼
我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
火温度，结果要么是很多带，要么没有。
请问大家有没有什么建议？
谢谢！
开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
火温度，结果要么是很多带，要么没有。
请问大家有没有什么建议？
谢谢！
i*n
6 楼
how much do you want to bring back?
you need to declare to US customs if >USD10k or equivalent, cash+cheques.
no people check at chinese customs
【在 c*******k 的大作中提到】
: 请问最多可以带多少美元回国？需要申报吗？谢谢
you need to declare to US customs if >USD10k or equivalent, cash+cheques.
no people check at chinese customs
【在 c*******k 的大作中提到】
: 请问最多可以带多少美元回国？需要申报吗？谢谢
t*b
7 楼
一直没找到湖南的，只有天津的有个同名的综艺节目。
r*n
8 楼
南传佛教：一直以来秉持人无我的小乘见解，缺乏大乘空性见与菩提心的教授。若能像
藏传佛教这样进行广大的闻思，必可真正步入自利利他的菩提之路。而与汉传佛教相比
，其素食观念也略显不足。虽然“三净肉”并未违背小乘戒律，但与大乘悲悯有情的精
神仍是相违。并且，尽管南传中也有利济社会的善举，但与汉传中广大弘法与饶益社会
人群的善行相比，显得过于狭隘。
藏传佛教这样进行广大的闻思，必可真正步入自利利他的菩提之路。而与汉传佛教相比
，其素食观念也略显不足。虽然“三净肉”并未违背小乘戒律，但与大乘悲悯有情的精
神仍是相违。并且，尽管南传中也有利济社会的善举，但与汉传中广大弘法与饶益社会
人群的善行相比，显得过于狭隘。
Z*5
9 楼
试一试touch down。 此外，做subclone可以考虑使用酶切。有时候不一定有直接的位
点可以使用，尝试一下有没有同尾酶或者用酶切之后补平等手段，总会有解决办法的。
ATG
【在 g*****n 的大作中提到】
: 我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
: 开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
: 向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
: 我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
: 火温度，结果要么是很多带，要么没有。
: 请问大家有没有什么建议？
: 谢谢！
点可以使用，尝试一下有没有同尾酶或者用酶切之后补平等手段，总会有解决办法的。
ATG
【在 g*****n 的大作中提到】
: 我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
: 开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
: 向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
: 我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
: 火温度，结果要么是很多带，要么没有。
: 请问大家有没有什么建议？
: 谢谢！
r*n
10 楼
按照版主的所谓标准，这种赤裸裸对小乘扭曲贬低的也应该被删除，至少不应该mark。
“一直以来秉持人无我的小乘见解，缺乏大乘空性见与菩提心的教授。若能像
藏传佛教这样进行广大的闻思，必可真正步入自利利他的菩提之路。而与汉传佛教相比
，其素食观念也略显不足。虽然“三净肉”并未违背小乘戒律，但与大乘悲悯有情的精
神仍是相违。并且，尽管南传中也有利济社会的善举，但与汉传中广大弘法与饶益社会
人群的善行相比，显得过于狭隘。”
“一直以来秉持人无我的小乘见解，缺乏大乘空性见与菩提心的教授。若能像
藏传佛教这样进行广大的闻思，必可真正步入自利利他的菩提之路。而与汉传佛教相比
，其素食观念也略显不足。虽然“三净肉”并未违背小乘戒律，但与大乘悲悯有情的精
神仍是相违。并且，尽管南传中也有利济社会的善举，但与汉传中广大弘法与饶益社会
人群的善行相比，显得过于狭隘。”
h*6
11 楼
Can you synthesize the first 60 bp and make changes to the sequence to
change the GC/AT ratio for PCR?
change the GC/AT ratio for PCR?
F*p
12 楼
有回文结构吗？
w*r
13 楼
对高GC的PCR，加1M betaine，dCTP/dGTP的量加倍，
然后DMSO 3-7% 和 退火温度一起，做一个二维的梯度试一下条件。
这个条件对付GC rich PCR，用了的都说好。
good luck!
ATG
【在 g*****n 的大作中提到】
: 我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
: 开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
: 向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
: 我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
: 火温度，结果要么是很多带，要么没有。
: 请问大家有没有什么建议？
: 谢谢！
然后DMSO 3-7% 和 退火温度一起，做一个二维的梯度试一下条件。
这个条件对付GC rich PCR，用了的都说好。
good luck!
ATG
【在 g*****n 的大作中提到】
: 我从ATCC买回一个质粒，打算PCR之后subclone到我的载体，但那个基因的5’端从ATG
: 开始的40个碱基只有三个A/T，GC含量是97%，但整个基因的总GC含量正常。我只好把正
: 向引物设计在质粒上，最后三个碱基和ATG重合。
: 我用了phusion polymerase的HF buffer，没有带。换了它的GC buffer，试了不同的退
: 火温度，结果要么是很多带，要么没有。
: 请问大家有没有什么建议？
: 谢谢！
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