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有用ABI3130 测序系统自己测序的兄弟姐妹么？我都急死了。
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有用ABI3130 测序系统自己测序的兄弟姐妹么？我都急死了。# Biology - 生物学
h*i
1 楼
给等待用点的参考一下：
月初申请的卡，消费了>$1000，22号出的账单。
Activity Amount Post Date Description
Earn +1658 07/26/2010 SPG AX BASE SPEND - CONSUMER
Earn +10000 07/26/2010 SPG AX NEW MBR BONUS
Earn +20000 07/26/2010 SPG AX NEW MBR SPEND BONUS-CSR
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r*C
2 楼
Continental的飞机，一般再那里接计较好？
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B*r
3 楼
正文 章五十三 如夜之寒
梅克斯一窒，眼中几乎要喷出火来，然后一口气就堵在口，怎么都吐不出来！她很
想把这句话砸回到尼瑞斯脸上，再塞进他的嘴里，他把这无力之极的话吞回去。www.|
dyzww.|com|第|一|中|文|网|.com|可是梅克斯好歹是圣域强者，又是血脉高贵，怎么
都做不到无视铁一般的事实。就是梅克斯心里，也确实要承认尼瑞斯的容貌确实比自己
要强出一个等级。
可她岂是那种需要靠脸吃饭的人？
尼瑞斯的这一击异常狠辣，正好地击中了梅克斯的软肋，让她根本无法不失仪态地
反击，一腔怒火只能生生咽回肚子里。
金贝叶终于站了起来，将梅克斯拉回来，按在座位上，轻声在她耳边说：“为了帝
国。”
梅克斯双眼喷火，怒吼道：“可是你也听到了！他刚才说了什么！”
“为了帝国！”这一次金贝叶伯爵加重了语气，梅克斯哼了一声，不再反驳。
压服了梅克斯，金贝叶伯爵这才在尼瑞斯面前坐下。
尼瑞斯冷笑道：“这一次又为了什么？别告诉我也是为了帝国！”
金贝叶微笑着说：“四皇子，这次是为了你的命运。因为我认为，和陪无定陛下睡
觉相比，你一定会觉得呆在我们的梅克斯小姐身边，就是天国。”
伯爵的话让尼瑞斯大吃一惊，他很想大笑，可是却笑不出来：“你这个玩笑……”
“这不是玩笑。”金贝叶从容地说：“我听说浊流大人第二批选妃的标准定在血脉
上。越是血脉力量纯正强大的人，就越容易被选中。殿下，您的容貌和血脉都是一时之
选，所以您觉得自己会被漏过去吗？”说到这里，金贝叶停顿了一下，微笑道：“就算
浊流大人一时疏漏，我也可以在适当时候提醒他一下。”
尼瑞斯腾地站起，又惊又怒：“你……你卑鄙！！”
金贝叶也站了起来，先是优雅行了一礼，才说：“我原本以为，在真正贵族的词典
里，是没有卑鄙这个词的。因为它早已融入我们的血脉。”
尼瑞斯脸转冷，说：“我从来不受威胁！”
“意气用事也不应该是贵族词典里的词汇。您难道愿意变成无定陛下的玩物？恕我
直言，因为殿下身上血脉的原因，恐怕用不了多久就会被无定陛下玩死。另外，我还听
到了一些不太好的流言，据说无定陛下对您的母族深恶痛绝。以无定陛下的脾气，有理
由的话一定会选择诛灭全族的。就算没有合适的理由，也总可以找出理由的。”金贝叶
伯爵说完，又坐了回去，双手十指悠闲地交叉起来，优雅地注视着四皇子。
尼瑞斯脸铁青，默然不语。虽然金贝叶伯爵已经算是公然胁迫了，可是尼瑞斯却偏
偏不能发作，对方所说的话赤/直白，把他一直想要逃避的现实扯到了光天化日之下。
一旦选妃这种见鬼的事真的落到自己头上，金贝叶伯爵这边也许是他惟一的退路。
过了片刻，看尼瑞斯没有丝毫准备再开口的意思。金贝叶伯爵站了起来，淡定从容
地说：“殿下，现在还有几天时间。您完全可以再考虑考虑。无定陛下虽然善战，但是
我们千年帝国有帝君座镇，想要保住您的母族还不在话下。时间不早了，我们也该回去
了。”
尼瑞斯呆呆站在原地，动都不动，就像一座雕像。
梅克斯在经过他面前时，忽然心中一动，伸手就在他脸蛋上摸了一把，笑道：“确
实长得不错，我喜欢！这次要定你了！哈哈！”
直到金贝叶伯爵一行远，尼瑞斯才长出一口气，一拳砸在石桌上！他这一拳用力极
重，又没运起分毫斗气保护自己，手上立刻血绽开。他任由鲜血流了一会，这才站起来
，收拾好了伤口和石桌上的血迹，离开了院落，进皇家图书馆。
此时夜已经深了，图书馆内空旷寂静，四顾无人。
尼瑞斯孤身一人在图书馆里寻找着，终于翻到了一本非常古老的典藉，封面上写着
《诸神遗产：论血脉》。他找了个桌子坐下，借着法灯的光芒，开始翻阅这本厚得出奇
的大书。
其中，在《血脉的融合与变异》一章中写着，当黄金月河遇到暗雷泰坦时，有可能
产生具有双血脉的后代，另外有很小的机率会产生具有更高等级未知血脉的后代。
写下这本书的是一位传奇般的人物：罗素。在他那个年代，罗素是整个位面屈指可
数的几位传奇法师之一，但他为人们所牢记的并不是一身足以纵横各大位面的强横力，
而是他在血脉理论上开拓的成就。
他一生中最伟大的著作，就是此刻在尼瑞斯手中的《诸神遗产》。这本书系统地讲
述了血脉的产生、浓郁或者稀薄，以及融合和变异等诸多问题。虽然罗素的许多理论还
是停留在猜想阶段，但仍然无损于他的伟大。
几百年之后，诺兰德于血脉上的认识并没在罗素的基础上前进多少。因此许多古老
的传统，比如说类似于阿克德家族的纯血通婚，依旧在大多数家族中通行。
在《诸神遗产》中，论血脉的融合与变异是与众不同的一章。在这一章里，罗素给
出了十余种血脉组合和提升的方案，其中有不少方案中提到的血脉，在罗素的年代还未
曾出现过。这倒不是罗素在信口胡说，而是因为他是预言系法的大师，因此在命运长河
中，罗素窥到了许多未来的片断。
罗素列出的众多血脉融合与提升方案中，有三分之一业已得到证实。这个比例已经
高到足以让人疯狂。所以对于那些列于书上的血脉搭配方案，哪怕机率再小，也总有人
愿意为此付出代价，进行尝试。千年帝国就是其中之一。
看到这里，尼瑞斯向后一仰，也不管脑袋撞到的是窗台还是书架，抬起手臂遮住了
自己的眼睛。他现在感觉，自己就象是一匹用来配种的种马。
梅克斯的黄金月河也好，皇的黑暗泰坦也罢，与尼瑞斯的暗雷泰坦相结合，都会有
较大机率诞生出血脉强大的后代。在任何有历史的家族中，血脉传承都是头等大事。只
是身为当事人之一的尼瑞斯，却不会觉得愉快。
而且从小接受皇子教育的他并不天真地以为配种就是事情的结束。配种如果成功，
等待他的会是更加赤/直接的交/配要求。配种如果不成功，以他纯血雷霆毁灭者、至少
是传奇强者起点的潜力，将会是很多人除之而后快的目标。
尼瑞斯的血脉天赋觉醒得太早了，他自身的力量还没有强大到能够保护自己。可是
暗雷泰坦又是《诸神遗产》上列名的血脉，压都压不住地直接进入第二阶段血脉具现，
在皇室诸多双强者的眼睛下根本无法隐藏。
而另一方面，原本能够给与他庇护的菲利浦又偏偏在这个时候死去。转眼之间，尼
瑞斯就象是一块被放在荒野上的肥，周围全是饥饿的豺狼。千年帝国只不过是第一头扑
上来的而已。
快要黎明了，窗外的夜幕格外的深沉。枯坐在图书馆里的尼瑞斯忽然打了个寒战，
深深感受到了夜的森寒。
清晨时分，李察已经出现在黑玫瑰古堡，带上数量众多的构装骑士，再次进入了法
罗位面。
当李察出现在久违的蓝水绿洲城内时，意识中立刻响起一阵轰鸣的大笑，然后是刚
德那标志的粗豪声音：“头儿！你终于回来了！你要是再不回来，我可能就要忍不住打
进铁三角去了！”
李察还没有来得及回答，另一个尖细柔媚的声音紧跟着响起：“李察主人，我认为
我应该跟随在您身边，时刻为您效力！”
这个声音听起来有些陌生，而且距离李察足有数百公里之遥。李察还要想一想，才
记得这是宗虎的声音。这位神孽之子接受了灵契约之后，也能够在一定距离里和李察以
意识直接沟通了。不过在李察的记忆中，宗虎应该是极度桀骜不驯的一个人，而且天喜
怒无常，喜欢背叛。怎么现在突然变得如此恭顺，甚至还有些谄媚了？
疑之时，母巢的声音传来：“主人，许久不见了。我现在正处于迄今为止最关键的
晋阶状态，需要您来为我指定方向。另外，在这次晋阶中我有可能觉醒真名，这个过程
会有一些危险。为了顺利晋阶，我需要宗虎的协助，请您准许他留在我的身边，时刻守
卫我，协助我晋阶。”
“不！！”宗虎一声尖叫，炸得李察也有点头疼，他奇怪怎么和母巢的对话会被宗
虎听到，随即明白过来。
母巢显然是故意又传了一份对话给宗虎，李察也知道宗虎为何会对母巢如此畏惧。
哪怕是神孽，每天被放几十轮的血，这种折磨也难以承受。偏偏宗虎还是近乎不死的身
体，因此折磨被千百倍地放大了。
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f*l
4 楼
除了长途电话那一块，其他没看明白有什么实际好处。给解释一下呗。
http://slickdeals.net/forums/showthread.php?sduid=0&t=2772331
Complete Google Voice integration for Sprint Customers (Free number
porting, SMS, Cheap international calls, etc.)
Sprint and Google have agreed to allow simple and full integration
between Sprint and Google Voice's phone numbers and services. This will
work for smartphones and and standard phones alike. Basically, if you
have a Sprint account, you can use your existing number with the Google
Voice service without having to void your contract or pay a porting fee
(which you have to do from other carriers). If you currently use Google
Voice's service, you can now integrate your Voice's phone number
directly with your Sprint phone without any tinkering or even needing to
install the app (although you probably should anyways). This may not
sound like a 'deal' at first to some, but if you are a Sprint mobile
customer, there are several reasons why this news can save you money:
Free number porting to Google Voice (normally $20)
Before it required a somewhat awkward step in-between cellular
contracts, which is something most of us aren't used to, and a $20 fee.
But now, Sprint customers don't have to break their contracts or pay a
$20 for this service as others do.
Free text messaging using the Google Voice app on Android or iPhone
If your phone can receive the Google Voice app, you can now make SMS
messages with your actual number for free. You'll have to use the Voice
app to generate the messages, but I find this interface to be much
better than most stock SMS managers anyway.
Incredibly cheap international calls straight from the phone (no app
necessary).
Google Voice's international rates are very similar to Skype's, but now
you won't have to use an app or find WiFi service to make cheap
international calls. This is especially important for non-smartphone
owners why don't have the ability to use a VoIP service. Now you can
call most of the world for a few cents.
All the additional benefits of Google Voice
Route calls from your Google Voice number to any other phones (cellular
or landline) that you want.
Manage Voicemail and Text Messages Through Email.
Set up "Do Not Disturb" rules.
Block unwanted callers.
Send Text Messages Through Your IM Client.
Record incoming calls.
Generate and receive calls from your computer.
So many more features to list...
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s*2
5 楼
我们实验室有套ABI 3130xl 测序系统，本来以前都是把样品送出去测序。这两天，老
板心血来潮，让我研究一下，用这台仪器自己测序。我都鼓捣一周了，结果试剂盒的阳
性对照可以出结果，测序结果也不错。但是自己的样品死活就是不出东西。希望熟悉这
台仪器的兄弟姐妹能给的点建议。谢谢！
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o*o
6 楼
cong
排包子
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q*g
7 楼
先拿行李，然后入关。
CO88？你买的机票什么价钱？
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M*G
8 楼
擦，罗素，波普尔什么时候出场？

【在 B*********r 的大作中提到】
: 正文 章五十三 如夜之寒
: 梅克斯一窒，眼中几乎要喷出火来，然后一口气就堵在口，怎么都吐不出来！她很
: 想把这句话砸回到尼瑞斯脸上，再塞进他的嘴里，他把这无力之极的话吞回去。www.|
: dyzww.|com|第|一|中|文|网|.com|可是梅克斯好歹是圣域强者，又是血脉高贵，怎么
: 都做不到无视铁一般的事实。就是梅克斯心里，也确实要承认尼瑞斯的容貌确实比自己
: 要强出一个等级。
: 可她岂是那种需要靠脸吃饭的人？
: 尼瑞斯的这一击异常狠辣，正好地击中了梅克斯的软肋，让她根本无法不失仪态地
: 反击，一腔怒火只能生生咽回肚子里。
: 金贝叶终于站了起来，将梅克斯拉回来，按在座位上，轻声在她耳边说：“为了帝
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b*n
9 楼
这个意思是说拨打国际长途直接在sprint手机上拨打对方号码就可以了？
（还是需要装个啥app或是先拨打自己号码然后等着GV回拨的？）
有人试过吗？
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o*r
10 楼
不写得详细一点没人能帮你
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c*s
11 楼
pai
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c*n
12 楼
应该是先办理入关手续，然后取行李。

【在 q********g 的大作中提到】
: 先拿行李，然后入关。
: CO88？你买的机票什么价钱？
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g*s
13 楼
泥马最近写的都是什么东西嘛
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t*n
14 楼
直接拨就行了，不需要装app，也不需要等回拨
你会听到，the cost of this call is 2 cents per minute，然后就是拨号音了
如果没有听到这个提示音就要当心了，可能就会走的是Sprint的国际长途，而非google
voice了

【在 b******n 的大作中提到】
: 这个意思是说拨打国际长途直接在sprint手机上拨打对方号码就可以了？
: （还是需要装个啥app或是先拨打自己号码然后等着GV回拨的？）
: 有人试过吗？
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s*2
15 楼
嗯,oldmonster 批评的是，我总觉得自己现在的表达水平骤降。我用的是BigDye
teminator cycle sequencing kit进行测序。试剂盒里面自带一个质粒和引物，作为
control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所以用量大）。我用
的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也是1.7-2.0。产物
和引物的比例是50ng：3.2pmol。进行cycle 标记，进行了25个循环。然后将标记后的
产物用Ethanol/EDTA 进行纯化。结果是：control出来结果很好，而自己的产物却只有
在很前面的地方有很高的几个峰，根本不是产物。所以我怀疑我的产物根本没有标记上
？不知道这样是不是还是不够详细。希望大家能够帮帮我！
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x*r
16 楼
nice!
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c*4
17 楼
严重同意！

【在 c********n 的大作中提到】
: 应该是先办理入关手续，然后取行李。
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m*n
18 楼
尖细柔媚的声音
宗虎正朝太監方向發展？
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b*n
19 楼
咦，这样不错啊
谢谢！

google

【在 t******n 的大作中提到】
: 直接拨就行了，不需要装app，也不需要等回拨
: 你会听到，the cost of this call is 2 cents per minute，然后就是拨号音了
: 如果没有听到这个提示音就要当心了，可能就会走的是Sprint的国际长途，而非google
: voice了
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l*n
20 楼
PCR amplicon纯化后再跑一个gel看看条带是不是很弱，如果很弱，要浓缩产物。尽可
能多加些模板DNA
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s*x
21 楼
你连楼主说的“出关”和你说的“入关”是不是一个东西都不知道，如何回答？
你可知道他说的“出关”是指什么？
1 过immigration
2 过customs
3 过cbp inspection
4 出中国的边防检查
5 以上都不是

【在 c********n 的大作中提到】
: 应该是先办理入关手续，然后取行李。
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k*c
22 楼
被母巢阉了？

【在 m***n 的大作中提到】
: 尖细柔媚的声音
: 宗虎正朝太監方向發展？
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t*n
23 楼
不客气！

【在 b******n 的大作中提到】
: 咦，这样不错啊
: 谢谢！
:
: google
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v*a
24 楼
PCR产物怎么纯化的？确定已经去掉PCR体系里的引物了？
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c*a
26 楼
母巢写了个email给李察，顺便cc给了宗虎。
宗虎选择了Reply All
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a*f
27 楼
别的好处还有，可以直接在网上用电脑收发短信, 用电脑接/打电话。还可以block 不
想接听的电话号码。语音留言会发transcript到你的email。
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T*t
28 楼
Control works means the sequencing kit is good. The only difference is your
template and primer. I would suggest the following:
1) purify your PCR product with a new kit;
2) double check your primer's sequence and quality (use it in regular PCR to
see if it can amplify your template);
3) do a serial dilution of your template and compare the results.
avatar
r*C
29 楼
got baggage first and then custom/immigrant office
co88 1350$ for round trip
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B*g
30 楼
似乎没有大用呀

【在 a*f 的大作中提到】
: 别的好处还有，可以直接在网上用电脑收发短信, 用电脑接/打电话。还可以block 不
: 想接听的电话号码。语音留言会发transcript到你的email。
avatar
i*a
31 楼
切胶纯化后的PCR产物作为模板的话，本来就很难成功
若是还不熟练的话，建议先将PCR产物先链接到现有的easy vector中扩增后
作为模板试试
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b*n
32 楼
那语音留言还可以直接在sprint手机上看到提示和查听吗？
如果只能从gmail信箱中查看语音留言那就杯具了。。。

【在 a*f 的大作中提到】
: 别的好处还有，可以直接在网上用电脑收发短信, 用电脑接/打电话。还可以block 不
: 想接听的电话号码。语音留言会发transcript到你的email。
avatar
b*m
33 楼
把你的原始文件，扩展名ab1，作为附件贴上来看看。

【在 s********2 的大作中提到】
: 我们实验室有套ABI 3130xl 测序系统，本来以前都是把样品送出去测序。这两天，老
: 板心血来潮，让我研究一下，用这台仪器自己测序。我都鼓捣一周了，结果试剂盒的阳
: 性对照可以出结果，测序结果也不错。但是自己的样品死活就是不出东西。希望熟悉这
: 台仪器的兄弟姐妹能给的点建议。谢谢！
avatar
a*f
34 楼

You can use the Google voice app on your phone.

【在 b******n 的大作中提到】
: 那语音留言还可以直接在sprint手机上看到提示和查听吗？
: 如果只能从gmail信箱中查看语音留言那就杯具了。。。
avatar
M*n
35 楼
how long is your PCR product?
what is your reaction volume?
My suspicion is you used too much template (very likely) or too little
template, given that all the other reagents (such as primers etc. ) are OK.
most likely you need reduce your template.
avatar
b*n
36 楼
啊，GV这个有wm 6.5的版本吗？
好象搜过没有找到啊。。。

【在 a*f 的大作中提到】
:
: You can use the Google voice app on your phone.
avatar
s*y
37 楼
嗯，我也怀疑这个。如果在一开始有几个特别高的峰然后后面就没有了的话，
一般就是因为前面几个位点的PCR效率太高，把所有的引物或者其他底物都用光了

.

【在 M*****n 的大作中提到】
: how long is your PCR product?
: what is your reaction volume?
: My suspicion is you used too much template (very likely) or too little
: template, given that all the other reagents (such as primers etc. ) are OK.
: most likely you need reduce your template.
avatar
F*P
38 楼
打电话可以不用手机。
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s*y
39 楼
建议楼主先试验一些比较容易做的条件，比方说用plasmid 做底物。
然后浓度和底物量什么的必须要优化一下，最好仿照说明书里面推荐的浓度来做。
avatar
c*n
40 楼
如果现在把sprint的号码port到GV，以后还能再转到其他carrier吗？
avatar
M*n
41 楼
this is such a waste of time for a phd or a student.
it is supposed to be a tech's job because all the conditions are well
established.
no innovation, no research.

【在 s******y 的大作中提到】
: 建议楼主先试验一些比较容易做的条件，比方说用plasmid 做底物。
: 然后浓度和底物量什么的必须要优化一下，最好仿照说明书里面推荐的浓度来做。
avatar
b*l
42 楼
怎么拨国内号
我拨了后直接还是走sprint啊
还是google vocie里要有钱啊
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s*y
43 楼
yeah, I agree :) Plus sequencing is very cheap nowaday.
But if their lab runs more than 100 sequencing a month, then it is much
cheaper to do it themselves. Remember it is not the motivation of the
student, but the motivation of the boss. Hiahiahia

【在 M*****n 的大作中提到】
: this is such a waste of time for a phd or a student.
: it is supposed to be a tech's job because all the conditions are well
: established.
: no innovation, no research.
avatar
M*n
44 楼
hehe, we run thousands of sequencing each months,but we have sent our
sequencer to others for free.
it is not worthy doing it by yourself, econimically and scientifically.
we once spent >$20K in a month for sequencing alone.

【在 s******y 的大作中提到】
: yeah, I agree :) Plus sequencing is very cheap nowaday.
: But if their lab runs more than 100 sequencing a month, then it is much
: cheaper to do it themselves. Remember it is not the motivation of the
: student, but the motivation of the boss. Hiahiahia
avatar
s*2
45 楼
纯化后，我也跑胶了，条带很单一。所以我一直觉得纯化没有问题，并且产物也很亮。

【在 l******n 的大作中提到】
: PCR amplicon纯化后再跑一个gel看看条带是不是很弱，如果很弱，要浓缩产物。尽可
: 能多加些模板DNA
avatar
s*2
46 楼
谢谢ThisjobIwant战友！应该不是引物的问题，因为引物做正常PCR没有问题的。我也
尝试着换不同浓度的DNA做模板了，还是不行。估计真是纯化步骤出问题了。我用的是
DNA纯化试剂盒，而不是PCR产物纯化试剂盒。可能没有把多余的引物还有dNTP的去掉。
所以我现在正在等待新的试剂盒。等做出来，再上来向大家回报。

your
to

【在 T**********t 的大作中提到】
: Control works means the sequencing kit is good. The only difference is your
: template and primer. I would suggest the following:
: 1) purify your PCR product with a new kit;
: 2) double check your primer's sequence and quality (use it in regular PCR to
: see if it can amplify your template);
: 3) do a serial dilution of your template and compare the results.
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s*2
47 楼
关键是我们老板的资金并不充足。在一周之类，稍微订的东西多了些，老板就要说，资
金紧张了。所以这也是给老板省钱的方式之一。不过这也算是掌握了一门技能，如果以
后找technican的工作，也有竞争力吧？（自嘲之语）

【在 M*****n 的大作中提到】
: hehe, we run thousands of sequencing each months,but we have sent our
: sequencer to others for free.
: it is not worthy doing it by yourself, econimically and scientifically.
: we once spent >$20K in a month for sequencing alone.
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M*n
48 楼
are you a phD? very few (almost nobody) will hire a phD to do "previous
generation" sequencing. if you are interested in sequencing, you had better
learn more about "next generation" sequencing, because that's getting hotter
and hotter.

【在 s********2 的大作中提到】
: 关键是我们老板的资金并不充足。在一周之类，稍微订的东西多了些，老板就要说，资
: 金紧张了。所以这也是给老板省钱的方式之一。不过这也算是掌握了一门技能，如果以
: 后找technican的工作，也有竞争力吧？（自嘲之语）
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s*2
49 楼
嗯，是phD。不过我不拿美国的学位，我只拿国内的学位。我只是作为交流学生来美国
待两年。我不是全职做测序，呵呵。我接触过next generation sequencing。并且我还
做过一部分这方面的工作。主要是我现在的工作是需要知道基因的一些序列。如果送给
公司测得话，必须凑够一板（96个）才可以，即使不够一板，也要charge一板的钱，所
以老板就不愿意浪费了。让我自己鼓捣着测测。从自己测得control来看，仪器，药品
都应该没有问题。就是要看自己的样品的了。一定得争气，希望能够测出来，呵呵。

better
hotter

【在 M*****n 的大作中提到】
: are you a phD? very few (almost nobody) will hire a phD to do "previous
: generation" sequencing. if you are interested in sequencing, you had better
: learn more about "next generation" sequencing, because that's getting hotter
: and hotter.
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s*2
50 楼
这个就是我得到的两个结果。sample就是自己的样品，另外一个是control。希望大家
能够帮帮我！谢谢了。

质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
是1.7-2.0。产物
产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。

【在 s********2 的大作中提到】
: 嗯，是phD。不过我不拿美国的学位，我只拿国内的学位。我只是作为交流学生来美国
: 待两年。我不是全职做测序，呵呵。我接触过next generation sequencing。并且我还
: 做过一部分这方面的工作。主要是我现在的工作是需要知道基因的一些序列。如果送给
: 公司测得话，必须凑够一板（96个）才可以，即使不够一板，也要charge一板的钱，所
: 以老板就不愿意浪费了。让我自己鼓捣着测测。从自己测得control来看，仪器，药品
: 都应该没有问题。就是要看自己的样品的了。一定得争气，希望能够测出来，呵呵。
:
: better
: hotter
avatar
b*r
51 楼
PCR产物里面有其他混杂污染或者引物残留，只要不是太多，根本不是问题，不要被他
们误导
我无数次直接用不纯化的PCR产物，加点引物去测序，只要band本身亮，》95%会出来，
最多是结果不太好看，有一些杂峰。你这个是根本没有信号
我看你这个可能是引物和产物不match。从另一头设计个反向引物做普通pcr看看能不能
扩出片段，还有再设计几条测序引物
另外我不觉得自己测序有什么了不起，这个东西劳动量根本不大，比起很多分子生物的
东西好多了。自己测序，对进度控制更好，而且如果测序量大，确实会省很多钱
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s*y
52 楼
这个很明显是你的底物浓度或者引物浓度用错了！
你这个在前面有几个巨大的峰，后面就没有峰了，说明你的PCR的前面几个反应把所有的
labeled nucleotide都用光了。
你必须回去严格检查一下你用的东西到底是什么浓度。比方说你会不会把没有稀释的引物
当成diluted working solution用了？
你应该把你的底物和引物的浓度稀释10~100倍再试一次。
另外，我建议你先用plasmid来试验一次，先不要急着用PCR product

【在 s********2 的大作中提到】
: 这个就是我得到的两个结果。sample就是自己的样品，另外一个是control。希望大家
: 能够帮帮我！谢谢了。
:
: 质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
: 以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
: 是1.7-2.0。产物
: 产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
: 度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
: 里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。
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s*2
53 楼
嗯，对，可能是这个问题。但是PCR产物的浓度应该不是问题，我都用分光光度计检测
过，并且用电泳法也估测了。那可能就是引物的问题了。我问一个比较弱智的问题，p
mol应该是10-12 mol吧？

有的
引物

【在 s******y 的大作中提到】
: 这个很明显是你的底物浓度或者引物浓度用错了！
: 你这个在前面有几个巨大的峰，后面就没有峰了，说明你的PCR的前面几个反应把所有的
: labeled nucleotide都用光了。
: 你必须回去严格检查一下你用的东西到底是什么浓度。比方说你会不会把没有稀释的引物
: 当成diluted working solution用了？
: 你应该把你的底物和引物的浓度稀释10~100倍再试一次。
: 另外，我建议你先用plasmid来试验一次，先不要急着用PCR product
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M*n
54 楼
yes pmol =1E-12 mol

p

【在 s********2 的大作中提到】
: 嗯，对，可能是这个问题。但是PCR产物的浓度应该不是问题，我都用分光光度计检测
: 过，并且用电泳法也估测了。那可能就是引物的问题了。我问一个比较弱智的问题，p
: mol应该是10-12 mol吧？
:
: 有的
: 引物
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s*y
55 楼
你把引物10~100倍稀释后再试吧

p

【在 s********2 的大作中提到】
: 嗯，对，可能是这个问题。但是PCR产物的浓度应该不是问题，我都用分光光度计检测
: 过，并且用电泳法也估测了。那可能就是引物的问题了。我问一个比较弱智的问题，p
: mol应该是10-12 mol吧？
:
: 有的
: 引物
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s*g
56 楼
看了楼主的帖子，觉得最好的方法就是先把产物连到质粒上，然后测序，这样比较容易
摸清反应条件。然后你再做直接测序也不迟。
我们实验室也做过产物直接测序，用Qiagen切胶盒子，效果很好，条件我们用的是10ul
体系：30ng模板+0.5ul 3.2uM引物，希望可以帮到你。
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s*2
57 楼
我已经严格检查了底物和产物的浓度，都是严格按照说明书来的，结果还是那个样子。
真是愁死我了。欲哭无泪呀。

有的
引物

【在 s******y 的大作中提到】
: 这个很明显是你的底物浓度或者引物浓度用错了！
: 你这个在前面有几个巨大的峰，后面就没有峰了，说明你的PCR的前面几个反应把所有的
: labeled nucleotide都用光了。
: 你必须回去严格检查一下你用的东西到底是什么浓度。比方说你会不会把没有稀释的引物
: 当成diluted working solution用了？
: 你应该把你的底物和引物的浓度稀释10~100倍再试一次。
: 另外，我建议你先用plasmid来试验一次，先不要急着用PCR product
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s*2
58 楼
嗯，我已经试了质粒了，结果也还是不行啊。我想问问，你用的是3.2uM的引物么？ABI
上建议用3.2pmol呢？

10ul

【在 s******g 的大作中提到】
: 看了楼主的帖子，觉得最好的方法就是先把产物连到质粒上，然后测序，这样比较容易
: 摸清反应条件。然后你再做直接测序也不迟。
: 我们实验室也做过产物直接测序，用Qiagen切胶盒子，效果很好，条件我们用的是10ul
: 体系：30ng模板+0.5ul 3.2uM引物，希望可以帮到你。
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s*2
59 楼
谢谢大家的帮助，我已经做出来了。哈哈。尤其感谢bwmcar，还有seagoing战友。在他
们的一再提示下，我终于明白了，我的引物浓度用的不对。告诉大家，我犯得低级错误
：我把pmol当成了pM？！我当时的脑子肯定被门挤了。所以我把我的引物稀释了106倍
以后再拿来当测序引物来用的！！！所以大家就拍死我吧。真心感谢大家给我提的建议
，才能引导我想到自己犯的低级错误。向大家鞠躬了。我是新手，也没有包子发给大家
。望大家见谅。
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b*r
60 楼
还是我的土法子好算吧
你有40多伪币，不要小气，起码发大叔我两个包子吧

【在 s********2 的大作中提到】
: 谢谢大家的帮助，我已经做出来了。哈哈。尤其感谢bwmcar，还有seagoing战友。在他
: 们的一再提示下，我终于明白了，我的引物浓度用的不对。告诉大家，我犯得低级错误
: ：我把pmol当成了pM？！我当时的脑子肯定被门挤了。所以我把我的引物稀释了106倍
: 以后再拿来当测序引物来用的！！！所以大家就拍死我吧。真心感谢大家给我提的建议
: ，才能引导我想到自己犯的低级错误。向大家鞠躬了。我是新手，也没有包子发给大家
: 。望大家见谅。
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s*y
61 楼
晕倒。这么低级的错误啊。
哈哈哈哈哈

【在 s********2 的大作中提到】
: 谢谢大家的帮助，我已经做出来了。哈哈。尤其感谢bwmcar，还有seagoing战友。在他
: 们的一再提示下，我终于明白了，我的引物浓度用的不对。告诉大家，我犯得低级错误
: ：我把pmol当成了pM？！我当时的脑子肯定被门挤了。所以我把我的引物稀释了106倍
: 以后再拿来当测序引物来用的！！！所以大家就拍死我吧。真心感谢大家给我提的建议
: ，才能引导我想到自己犯的低级错误。向大家鞠躬了。我是新手，也没有包子发给大家
: 。望大家见谅。
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s*2
62 楼
哈哈，是呀，这么低级的错误，搞的我郁闷了两个周了。bmwcar战友，我真是不知道怎
么发包子呢。你教我，我有多少包子，就发给你一半，剩下的一般给seagoing战友。
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b*r
63 楼
你到家页你那个人像右边金融中心里，个人银行业务，转账给bmwcar 20伪币就可以了
，10块算一个包子

【在 s********2 的大作中提到】
: 哈哈，是呀，这么低级的错误，搞的我郁闷了两个周了。bmwcar战友，我真是不知道怎
: 么发包子呢。你教我，我有多少包子，就发给你一半，剩下的一般给seagoing战友。
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M*n
64 楼
congrats
你可以到我们这儿的sequencing core来当个工作了。
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k*s
65 楼
这是sequencing PCR reaction根本没有开始，有几个可能
1. 你的引物的Tm太低，在同样退火温度下，引物没有结合好。
2. 模板的溶度太低。
3. 模板样品里面有抑制PCR反应的物质，比如EDTA
另外BigDye很稳定，自带的对照肯定能做出来，因为样品最纯的，引物M13也是最常用
的，本身做这个对照没有意义。

质粒和引物，作为control，产物和引物比例是200ng：3.2pmol（因为是双链质粒，所
以用量大）。我用的是纯化后的PCR产物和自己的引物，并且产物纯化后的A260/A280也
是1.7-2.0。产物
产物纯化试剂盒，利用了专门用于测序的那种纯化试剂盒。第二，我尝试着用了DNA浓
度梯度。但是出来的结果都是一样的。只是在最前面有几个峰。我真是不知道到底是哪
里出问题了。希望大家能够帮我分析一下。注： 后面有结果图片。

【在 s********2 的大作中提到】
: 哈哈，是呀，这么低级的错误，搞的我郁闷了两个周了。bmwcar战友，我真是不知道怎
: 么发包子呢。你教我，我有多少包子，就发给你一半，剩下的一般给seagoing战友。
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