有人尝试过SINGLE-CELL RT-PCR么？# Biology - 生物学
A*r
1 楼
打Skype的时候，对方听不到说话，彻底是静音。刚才试了一下，接了外接音箱就还是
可以用。应该怎么办？郁闷啊。
可以用。应该怎么办？郁闷啊。
w*e
2 楼
在老鼠模型中，不同的细胞颜色不同
然后PATCH不同的细胞，做感兴趣的基因是否表达在某个颜色的细胞
只需要做REVERSE TRANSCRIPTASE PCR回答YES OR NO
谢谢
然后PATCH不同的细胞，做感兴趣的基因是否表达在某个颜色的细胞
只需要做REVERSE TRANSCRIPTASE PCR回答YES OR NO
谢谢
h*8
3 楼
不知道为什么 我的skype 在ipad上也用不了，根本没有拨号音，无论拨美国手机还是
中国号码。请问有知道是咋回事的嘛？
中国号码。请问有知道是咋回事的嘛？
F*e
4 楼
yes
I ever did this experiment using nest pcr
【在 w*e 的大作中提到】
: 在老鼠模型中，不同的细胞颜色不同
: 然后PATCH不同的细胞，做感兴趣的基因是否表达在某个颜色的细胞
: 只需要做REVERSE TRANSCRIPTASE PCR回答YES OR NO
: 谢谢
I ever did this experiment using nest pcr
【在 w*e 的大作中提到】
: 在老鼠模型中，不同的细胞颜色不同
: 然后PATCH不同的细胞，做感兴趣的基因是否表达在某个颜色的细胞
: 只需要做REVERSE TRANSCRIPTASE PCR回答YES OR NO
: 谢谢
x*o
5 楼
You need headset with mic. Find in amazon for a few bucks, for iPhone
w*e
6 楼
谢谢
【在 F**********e 的大作中提到】
: yes
: I ever did this experiment using nest pcr
【在 F**********e 的大作中提到】
: yes
: I ever did this experiment using nest pcr
A*r
7 楼
以前一直都可以直接用的。
【在 x******o 的大作中提到】
: You need headset with mic. Find in amazon for a few bucks, for iPhone
【在 x******o 的大作中提到】
: You need headset with mic. Find in amazon for a few bucks, for iPhone
S*s
8 楼
我在培养的 293 和 Neuron 里都做过，蛮简单。不过如果你打算从老鼠的脑切片里做
这个实验，怎么样得到单细胞是一个大问题。莫非把组织打散成单细胞，然后用 cell
sorting 去得到某个颜色的细胞？
【在 w*e 的大作中提到】
: 在老鼠模型中，不同的细胞颜色不同
: 然后PATCH不同的细胞，做感兴趣的基因是否表达在某个颜色的细胞
: 只需要做REVERSE TRANSCRIPTASE PCR回答YES OR NO
: 谢谢
这个实验，怎么样得到单细胞是一个大问题。莫非把组织打散成单细胞，然后用 cell
sorting 去得到某个颜色的细胞？
【在 w*e 的大作中提到】
: 在老鼠模型中，不同的细胞颜色不同
: 然后PATCH不同的细胞，做感兴趣的基因是否表达在某个颜色的细胞
: 只需要做REVERSE TRANSCRIPTASE PCR回答YES OR NO
: 谢谢
A*r
9 楼
可以用了。估计是这两天skype那个软件坏了。
我今天晚上试了一下，就突然能用了。
【在 h******8 的大作中提到】
: 不知道为什么 我的skype 在ipad上也用不了，根本没有拨号音，无论拨美国手机还是
: 中国号码。请问有知道是咋回事的嘛？
我今天晚上试了一下，就突然能用了。
【在 h******8 的大作中提到】
: 不知道为什么 我的skype 在ipad上也用不了，根本没有拨号音，无论拨美国手机还是
: 中国号码。请问有知道是咋回事的嘛？
w*e
10 楼
初步打算先用酶消化，然后测试细胞的功能，目前已经成功
下一步：
想通过RT-PCR来确定我们测试的细胞是不是MUTANT细胞。
因为我们是CRE/LOXP老鼠，不能保证所有细胞都是MUTANT细胞，而且不同的细胞，表型
也不一样
谢谢
cell
【在 S*****s 的大作中提到】
: 我在培养的 293 和 Neuron 里都做过，蛮简单。不过如果你打算从老鼠的脑切片里做
: 这个实验，怎么样得到单细胞是一个大问题。莫非把组织打散成单细胞，然后用 cell
: sorting 去得到某个颜色的细胞？
下一步：
想通过RT-PCR来确定我们测试的细胞是不是MUTANT细胞。
因为我们是CRE/LOXP老鼠，不能保证所有细胞都是MUTANT细胞，而且不同的细胞，表型
也不一样
谢谢
cell
【在 S*****s 的大作中提到】
: 我在培养的 293 和 Neuron 里都做过，蛮简单。不过如果你打算从老鼠的脑切片里做
: 这个实验，怎么样得到单细胞是一个大问题。莫非把组织打散成单细胞，然后用 cell
: sorting 去得到某个颜色的细胞？
h*8
11 楼
对滴 你说的对 现在可以用了
不能用了好几天 怎么也不见个人抱怨下呢..
【在 A*********r 的大作中提到】
: 可以用了。估计是这两天skype那个软件坏了。
: 我今天晚上试了一下，就突然能用了。
不能用了好几天 怎么也不见个人抱怨下呢..
【在 A*********r 的大作中提到】
: 可以用了。估计是这两天skype那个软件坏了。
: 我今天晚上试了一下，就突然能用了。
w*e
12 楼
还有就是：
请问你是怎么提取的M-RNA，然后逆转录为C-DNA
cell
【在 S*****s 的大作中提到】
: 我在培养的 293 和 Neuron 里都做过，蛮简单。不过如果你打算从老鼠的脑切片里做
: 这个实验，怎么样得到单细胞是一个大问题。莫非把组织打散成单细胞，然后用 cell
: sorting 去得到某个颜色的细胞？
请问你是怎么提取的M-RNA，然后逆转录为C-DNA
cell
【在 S*****s 的大作中提到】
: 我在培养的 293 和 Neuron 里都做过，蛮简单。不过如果你打算从老鼠的脑切片里做
: 这个实验，怎么样得到单细胞是一个大问题。莫非把组织打散成单细胞，然后用 cell
: sorting 去得到某个颜色的细胞？
S*s
13 楼
我觉得你这个实验比较适合用 cell sorting 来做。取单细胞做 Single cell PCR 的
时候细胞周围溶液容易被周围破裂了的细胞污染，假阳性率很高，而且样品也不容易有
代表性。做 cell sorting 的话不同颜色的细胞收集下来多洗一洗，破损细胞的 RNA
去除得干净一些，还能在一个很大的样本量上比较不同颜色细胞的 RNA 表达，听起来
更靠谱一点。
我在培养细胞里做 Single Cell PCR。把 293 或者 culture neuron 用酶消化，用
PBS 稀释得非常淡，1：1000-3000吧，在显微镜下找到单细胞，用一微升的枪把细胞吸
进枪头，然后就是按照 cDNA kit 的配方直接做 cDNA，也没用特殊的步骤破细胞。我
用的 ABI 的 kit，做出来的 cDNA 有 10 微升，全部用来做 PCR。
【在 w*e 的大作中提到】
: 初步打算先用酶消化，然后测试细胞的功能，目前已经成功
: 下一步：
: 想通过RT-PCR来确定我们测试的细胞是不是MUTANT细胞。
: 因为我们是CRE/LOXP老鼠，不能保证所有细胞都是MUTANT细胞，而且不同的细胞，表型
: 也不一样
: 谢谢
:
: cell
时候细胞周围溶液容易被周围破裂了的细胞污染，假阳性率很高，而且样品也不容易有
代表性。做 cell sorting 的话不同颜色的细胞收集下来多洗一洗，破损细胞的 RNA
去除得干净一些，还能在一个很大的样本量上比较不同颜色细胞的 RNA 表达，听起来
更靠谱一点。
我在培养细胞里做 Single Cell PCR。把 293 或者 culture neuron 用酶消化，用
PBS 稀释得非常淡，1：1000-3000吧，在显微镜下找到单细胞，用一微升的枪把细胞吸
进枪头，然后就是按照 cDNA kit 的配方直接做 cDNA，也没用特殊的步骤破细胞。我
用的 ABI 的 kit，做出来的 cDNA 有 10 微升，全部用来做 PCR。
【在 w*e 的大作中提到】
: 初步打算先用酶消化，然后测试细胞的功能，目前已经成功
: 下一步：
: 想通过RT-PCR来确定我们测试的细胞是不是MUTANT细胞。
: 因为我们是CRE/LOXP老鼠，不能保证所有细胞都是MUTANT细胞，而且不同的细胞，表型
: 也不一样
: 谢谢
:
: cell
S*s
14 楼
我这个方法取细胞的时候有点打哪儿指哪儿的意思，在可见光下取细胞，取到什么做什
么。这在我的实验中体现了 random selection，就是不知道在你的实验里是不是适用
。这个实验里把细胞高度稀释是为了方便取单细胞，也是为了避免死细胞的污染。不过
你把细胞稀释了之后如果也是在可见光下取细胞不知道各种颜色的细胞是不是都能取到
，要是用了荧光取细胞，似乎就不容易看到枪头的位置。我做电生理的时候是用荧光找
到细胞，然后在可见光下把电极放到细胞上。经供参考吧。Good luck!
么。这在我的实验中体现了 random selection，就是不知道在你的实验里是不是适用
。这个实验里把细胞高度稀释是为了方便取单细胞，也是为了避免死细胞的污染。不过
你把细胞稀释了之后如果也是在可见光下取细胞不知道各种颜色的细胞是不是都能取到
，要是用了荧光取细胞，似乎就不容易看到枪头的位置。我做电生理的时候是用荧光找
到细胞，然后在可见光下把电极放到细胞上。经供参考吧。Good luck!
w*e
15 楼
Thanks a lot. I will try and might ask you later if have more problems.
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