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SeMet labeled protein# Biology - 生物学
I*a
1
搬家到外州,公司同意work from home, 需要通知移民局吗?
谢谢。
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c*0
2
2018年H1B签证申请材料及时间表
2018年H1B签证 申请材料及时间表。从2017年开始,H1B申请已经没有加急服务了。要
想顺利进行H1B申请,必须按时准备好所有的H1B签证材料。
2017年11月到12月
这段时间是指在H1B申请 的前一年就要开始准备,例如:想要申请2018年的H1B抽签,
就需要在2017年的11月到12月之间开始准备。主要需要申请者与雇主沟通并达成共识,
确认雇主愿意帮急忙申请H1B,此时申请者的身份还是在美合法工作的OPT身份。
1月至2月
当申请者与雇主达成了H1B签证申请 的共识之后,在当年的1月到2月需要申请者所做的
就是熟悉H1B申请流程并开始准备申请文件。
3月
进入到3月,需要申请者完成所有H1B签证材料并按时间要求寄送出去。比较合理的时间
安排是:
3月第一周
H1B签证申请者可申请LCA(Labor Condition Application),即劳工情况申请。考量
到LCA得到获批也一般需要7天,LCA申请也可在2月中就开始进行申请。LCA是以公司名
义申请,目的为表明公司的职缺招募不到美国劳工,进而为该职缺申请H1B。在申请LCA
时需要填写很多公司资讯,故建议由公司方来填写。注意在与公司沟通的时候需要申请
者与公司达成关于职称(job title)和薪资(wage)的共识,职称最好与毕业科系相
称,薪资也必须符合当地区域对于该专业和该职称的法定工资(prevailing wage)标
准。
3月第二周
H1B签证 申请者开始填写I-129表格(Petition for a Nonimmigration Worker)。在
网上下载好之后填写: (1)Petition for a Nonimmigration Worker (1-8页) (2
)选择H Classification Supplement 补充文件部分填写(13-18页) (3)还有Data
Collection and Filling Fee Exemption Supplement 部分(19-21页)
3月第三周
需要H1B签证 申请者在寄送之前整理并确认所有申请资料,包括:一张cover letter、
支票、所有申请表格、其他补充文件、和副本Duplicate Copy,如有遗漏或需要补充的
地方应尽快补齐。
3月第四周-4月1日
H1B签证 申请者应在3月的最后一周最后确认所有需要递交的申请材料并寄出,最好能
在4月1日当天寄达,或是在之后5个工作日之内寄达,提早寄到会被退件。
4月1日至4月中旬
H1B签证 抽签的时间。
4月中旬陆续至6月底
等待H1B签证 抽签结果通知。移民局不会在抽完签之后一次性向所有申请者公布结果,
而是耗时至少两个月才全数公布完成。若收到移民局的官方书面或email通知,则代表
H1B抽签成功。但被抽中之后还要经过官方神秘案审查所有资料,审核通过之后才算正
式拿到H1B身份。若缺档案或档案不符合法律标准,移民中心会发出补件通知(REF),
需要申请者尽快提交补充档案至指定地址。审核通过之后,移民局就会寄送I-797通知
,代表H1B身份已核准,这是日后办理H1B必备的文件。如果申请者成功抽中H1B,OPT身
份也会自动延长至9月30日。H1B会在10月1日正式生效。若没有抽中,申请者则即刻失
去合法居留资格,想要继续留下的话需要立即转换身份。
H1B签证申请费用
H1B签证交给移民局的基本费用会在$1,710到$2,460之间。其中申请费$460,防欺诈费
用$500,公司培训费用 (ACWIA):25人以下公司:$750;25人以上(含)公司:$1,500,
加急费用 (非强迫,Optional) :$1,225
想讨论H1B申请的也可以加微信:offerhacks 我拉大家进H1B 互助小分队
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Z*i
3
进入九月,辽东开始秋收,登州的经济战也到了尾声,整个北直隶和运河地区都被洗劫
了一番,有商人赚钱,也有商人大亏,登州总共投入了二百四十万两银子炒作粮价,平
均采购价格二两出头,最后卖出的价格平均在四两上下,最后剩下的十万石粮食售价大
概会低于采购价,但总体已经赚了近两百万两银子。
宁远的粮价被突然打压到了二两,吴襄和祖大寿亏了五六十万两银子,不过他们前
面粮荒时候也赚了一笔,最终亏得最惨的是关宁地区的士兵和家眷,他们辛苦挣到手的
军饷又被各家瓜分了一次。
另外损失大的便是往关宁做粮食生意的行商,其中还包括很多中层京官的店铺,他
们手中屯了大量粮食,开始阶段又没有吴襄这些人赚得多,总体实力也远不如祖家军,
遭受了致命打击。
青州府和济南府的兵乱之后,京师的不少科道御史将陈新视为与祖大寿一般的军阀
。这次粮荒,有些清贫的御史被害得不浅,四海商社的背景京官也有所耳闻,虽然他们
看不到陈新的大棋局,但对于京师权贵参与哄抬京师粮价是能看出来的。
所以这次经济战结束之后,御史又掀起一次弹劾陈新的高潮,当然也包括祖大寿等
人,连带弹劾参与炒粮的京师权贵,弹章雪片一般飞入宫中,不过这些弹劾大多被皇帝
留中不发。
因东厂听记引起的登州的兵乱风波慢慢平息,王廷试上疏弹劾东厂大档头姜月桂欺
压将官引起兵乱,崇祯下旨斥责了姜月桂的行为,取掉了姜月桂家中世袭的锦衣卫百户
,算是服了登州的软。随后又发了一道安抚乱兵的圣旨,对此次参与兵乱者一律不追究
,只是对领兵的耿仲明、范守业、代正刚等人罚俸了事。
安抚的圣旨下来之后陈新见好就收,两营战兵很快返回驻地,耿仲明也从济南府回
来了登莱又恢复了表面的平静。
陈新没有再继续追究卢传宗的事情,在朝廷这边,就让这事落个不明不白。对登州
镇内部传达的则是卢传宗企图投靠建奴,原因则是东厂姜月桂非礼其家眷,卢传宗走投
无路准备去辽东投建奴,虽是事出有因,但罪不可恕,整个事情定下的调调都是朝廷的
过错造成的,但叛逃同样会处死。其中的真相只有登州高层知道,高级一些的军官也多
少知情,也起到了警告全军的效果。
政治上则是得失参半,此次登州镇清除登莱内部的钉子刘泽清,又兵逼济南府,给
朝廷实实在在展示了一下军威,让皇帝和朝廷都只能做出让步,以后他们不会再搞小动
作来刺激登州。
坏处则是皇帝对登州戒心大增据宫中的消息,皇帝又砸了些瓷器,虽然他在大臣面
前认可了处罚姜月桂但心中还是认定是陈新在背后指使,以后要那些官方的政策就不好
要了。不过陈新也相信崇祯不敢断自己的辽饷。
额外的好处也有,陈新拔除了王廷试的心腹刘泽清,那支奇兵营也被解除武装登州
镇内只有巡抚标兵的三个营头不在登州镇控制下。陈新借此稳固了登莱形势,朝廷的力
量被完全驱逐出登莱乡间,只有登州城内还有王廷试和吕直的势力。
借着这次的机会,行动队清除了不少青州府的缙绅,趟地虎也出来了几趟,将原本
不好处理的几处地方扫平了,青州乡间敢和登州作对的宗族势力偃旗息鼓,登州的屯堡
正在加速扩张。
登州镇屯堡占据的耕地面积总数达到了二百四十万亩,这个数字已经能和那些藩王
的纸面封地相比。在登州和莱州所属乡间完全占据优势。其中平度州占地一百五十万亩
,占了平度耕地面积的六成,在青州府的占地达到了四十万亩,设立屯堡八十余个,并
且在兵变之后加快了步伐。半独立状态的辽南则开发出七万亩耕地,因为地处前线,屯
堡设立的密度更大,达到了二十个,以形成依托屯堡的防御纵深。
登州的屯堡总数为四百九十三个,人口一百零五万人,除了这些屯户之外,还有大
批流民拿着屯户户籍进入登莱的各种工厂,各个屯堡去外围也形成了一些社区,这些人
靠运输等临时劳力为生,也有在屯堡周围做从事服务业的人,登州各处繁荣的商业和充
足的人口给他们创造了不少工作岗位。
登州镇属下的总人口已经达到一百四十余万人,每天依然有源源不断的流民到来,
登州依然需要更多的土地安置人口。
作为经济战附属品的棉布大战也结束了,棉花价格曾在八月下旬被压到了最低,棉
商损失惨重,收棉比较晚的棉农砸在了手上,刘民有为了不影响第二年的种植面积,九
月又开始加大收货数量,以免棉农尽数破产而使得来年山东棉花大量减产,那样的话登
州镇就没了原料供应地。
棉布价格在缓慢回升,棉农又得以缓了一口气,但并非每个地区都在回升,青州府
南部也大量种植棉花,这里离运河较远,中间隔着衮州府,却靠近莱州府灵山卫,往年
有江南商人来采购,也有运河收棉的商人过来,去年还多出了灵山卫的登州棉布厂采购
,是不愁销路的。
但到了今年行情就不同了,运河棉布价格的波动影响到了江南和运河商人,这些商
人都在谨慎观望,青州府到运河路途较远,成本原本就高出一截,棉商不愿冒太大的风
险,而登州棉厂也不来采购,刘民有刻意减少青州府的购棉价格,让部分自耕棉农破产
,不得已变成流民投入了登州屯堡,另一方面则是想减少青州府的种棉面积,如今天灾
一年比一年严重,刘民有需要在登莱青三府扩大粮食种植面积,经济作物则依靠向外购
买。
登莱各地九月开始种植冬小麦,又是一片忙碌,刘民有的民事部忙着这个最重要的
事情宋闻贤的外务司派出吏员拜访山东各地地方官,消除兵乱之后各地对登州镇的疑虑
,另外也有专人去东江镇各岛。
陈新则忙着与王廷试和吕直修补关系然后不断视察军队系统,包括预备兵、集训基
地和驻扎登莱的四个战兵营,新的三千新兵训练完成后原来缺编的两个营全部满员,在
天津赖了三个月的最后一个千总部也到达登州,尽数返回驻地。这些战兵平时都是分散
驻扎,由各处屯堡分片供应后勤,能减少运输损耗,减小后勤的困难只有在进行合练和
作战时才会大规模集结。
算上祝代春的第五营,登州正规军已经有三万六千人,其中新兵不到五千人,全军
训练有素,近三万人具有作战经历,九边虽号称数十万大军,却无一镇能与登州这三万
人相提并论。登州镇所有军队回归驻地后,登莱稳如泰山,陈新也松了一口气乱七八糟
的大半年总算要过去了。
辽南却并未消停,登州镇的秋收攻势从八月底就展开,登州驻扎在复州的骑兵和龙
骑兵大举出击在盖州附近与建奴游斗。复州至盖州之间原有堡垒和驿站十余处,后金兵
放弃了大部分,后撤至榆林铺布防,缩短自己的后勤供应线。登州镇占据这些废弃的堡
垒后略微改建,便成为骑兵的临时据点,兼做烽火台的作用。
有了这些临时据点,登州骑兵获得了简单的依托,作战方式更加灵活,哨骑不断越
过盖州袭击耀州堡以南地区,已经威胁到后金辽中的粮食产地,同时耀州还是建奴食盐
的供应地,一旦这里丢失,建奴连盐都要靠走私了。
除了盖州之外,朱国斌出动了一个步兵千总部,与东江镇配合,从岫岩出发沿草河
河谷北上,一直攻击到了连山关附近。东江镇则重新占据了铁山,并重新占据了建奴放
弃的宽甸等地,还不断派出分兵往北袭击赫图阿拉一线。
辽南和东面两个防线的全线骚扰,逼得建奴进行了动员,正黄旗、正白旗、镶红旗
和正蓝旗出动了五千甲兵到最要紧的盖州布防,另外四旗则防守东面的漫长防线,总共
出动的兵力超过万人,包衣超过一万五千,甲兵和包衣都要自带行粮和马匹,加剧了后
金粮食的消耗。
双方在盖州至复州之间的无人区反复拉锯,互有伤亡,建奴增兵至五千后,双方暂
时处于对峙状态。辽西的关宁军态度暧昧,祖大寿派出祖大乐,带着一千骑兵到原来的
大凌河附近转了一圈,然后又回去了,谁也不知道他们要干什么。
到了九月十九日,陈新从辽南视察冬季防御部署返回登州,刚到总兵府,副官就送
来一封信件,陈新看完后唤过副官,让他去请代正刚来见面。
代正刚就在登州,这次处置卢传宗等阳谷系之后,侍从室和兵务司接管了第二营,
代正刚依然是营官,只是只是临时调回登州。陈新晾了他一段时间,等到了这封辞呈。
代正刚很快到了陈新的公事房,陈新一见面就道:“正刚,你的辞呈本官看了,不
准。”
代正刚连忙站起来,陈新挥手让他坐下,“本官知道你担心什么,卢传宗的事情,
是东厂弄出来的,现在人已经死了,姜月桂也死了。他们背后有什么道道,本官也不想
再问。卢传宗是卢传宗,你代正刚是代正刚,你不要给自己打上一个阳谷的标签,徐元
华也是阳谷来的,与卢传宗的关系更近,本官照样要用他,咱们不搞清洗那一套。”
代正刚沉默了一下道:“大人,这事确实与东厂有关,但说到底,还是卢驴子自己
没有站稳。卢传宗是属下带出来的,他的脾气一贯就是心高气傲,受不得一点委屈。此
次无论死因如何,皆是因其与东厂番子私下接头所致,属下责无旁贷,请大人免去属下
的军职,属下愿意去民事部,或是让属下当个教官亦可。”
陈新摆手道:“卢传宗是卢传宗,你代正刚是代正刚,你不要自己给自己打上一个
阳谷的标签,徐元华也是阳谷来的,与卢传宗的关系更近,但他迷途知返,又有管民事
部的能耐,所以本官照样要用他,咱们不搞清洗那一套。”
代正刚低着头,也不知听进去没有。陈新也知道他心中会有些顾虑,但代正刚和卢
传宗不同,情报局对他性格的分析是颇为沉稳,而且十分顾家,如今他在登州有有家有
室,子女四个,很早以前就刻意拉远与卢传宗等人的关系,阳谷系的聚会很少去参加,
只有过年节之时与这些同乡走动一下。
陈新走到代正刚身边拍拍他肩膀道:“你和传宗都是最早跟本官的,威海时候那么
难,不也过来了,本官不是不念旧情的人,其中的意思,你应该明白。卢传宗是自己没
有站稳,跟你没有关系。本官信得过你,但本官也知道你心头的顾虑,若你实在不愿带
兵,便去武学与石平利换换,你打的仗也不少了,武学正好也缺你这样的军官。”
代正刚感激的敬礼道:“谢过大人体谅,属下明日便去文登。属下也一直记着跟大
人到威海的时候,日子虽苦,却也满心欢喜,属下一直念着大人的好,要不是当年大人
尚在草莽,在天津河边便救了小人一次,若非大人收留,俺可能早已不知死在何处。这
次请辞非是担心大人会牵连属下,只是那卢传宗与小人自小便识得,这是众人皆知之事
,军中总会有些说法,属下若是继续管着第二营,军中同僚防备起来,也无趣得紧,还
会误了大人的大事,还是武学稳妥些。请大人放心,属下一定会帮大人把武学管好。”
陈新微微点头道:“帮本官把武学管好一点。以后心里想通了,再来找本官,再带
兵也不是不行的。”
代正刚再次敬礼后,大步出门而去,陈新看着关上的门叶叹口气道:“这样也好,
希望咱们善始善终。”
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y*l
4
大家好,我最近拿到了一个十二个跨膜结构膜蛋白的晶体,正在做SeMet标记晶体。
我用的菌株是:B834(DE3)
培养基:M9+19个氨基酸+0.5%glycerol+ 5%glucose +Thiamine+1mM MgSO4+0.1mM
CaCl2+0.05mg/ml selenomethionine+amp
温度:37°
培养时间:24小时
用这样的方法,没4L菌可以大概拿到3毫克的蛋白。
现在问题是3毫克蛋白根本不够我用来长晶体。
问题:
1.在养细胞的时候我发现离心以后上清还是很浑浊,还有大量的菌在上清中无法被离下
来。我
加大了离心的速度和时间,还是无法离下来。有好多菌附着在离心管壁上。不知道这是
为什
么?
2.离下来的菌有一些黄黄的东西,而且是比较多的。通过我的纯化,我发现这些黄黄的
东西是
不能被detergent溶解的,里面没有我的目的蛋白。不知道这些黄黄的东西是什么?
3.离下来的菌在悬在buffer的时候,我发现很粘稠,和我用与表达非标记蛋白用到的菌
的时候
是完全不一样的。是不是菌破裂了,dna跑了出来。很奇怪。
4.长SeMet derivative protein的晶体时,我发现和非标记的蛋白行为不太一样。在相
同的条
件下,或者附近的条件下,标记蛋白发生轻微的brown沉淀。晶体没有长出来。感觉不
像能长
出来的样子。
5. 在浓缩蛋白的时候,我发现蛋白发生沉淀而堵塞了离心管。不是特别严重,很明显
。我用
的detergent是beta-DDM.
希望有知道的同仁能帮我解释一些这些原因,不胜感谢!
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p*1
5
无论是否H1B,甚至失业..
无论是否有CASE PENDING WITH USCIS..
无论是否换工作...
只要你换了地址, 即使你从同一条街的#3 搬到了隔壁#4...
都要通知USCIS: Form AR-11, 可以ONLINE填写:
https://egov.uscis.gov/crisgwi/go?action=coa

【在 I*******a 的大作中提到】
: 搬家到外州,公司同意work from home, 需要通知移民局吗?
: 谢谢。

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a*g
6
这话说的,“这样也好,希望咱们善始善终。”
以后陈主任会不会火拼刘宅男
avatar
J*n
7
Na+ channel?
Congrats!

【在 y****l 的大作中提到】
: 大家好,我最近拿到了一个十二个跨膜结构膜蛋白的晶体,正在做SeMet标记晶体。
: 我用的菌株是:B834(DE3)
: 培养基:M9+19个氨基酸+0.5%glycerol+ 5%glucose +Thiamine+1mM MgSO4+0.1mM
: CaCl2+0.05mg/ml selenomethionine+amp
: 温度:37°
: 培养时间:24小时
: 用这样的方法,没4L菌可以大概拿到3毫克的蛋白。
: 现在问题是3毫克蛋白根本不够我用来长晶体。
: 问题:
: 1.在养细胞的时候我发现离心以后上清还是很浑浊,还有大量的菌在上清中无法被离下

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I*a
8
谢谢楼上的。
我的意思是除了这个换地址,是否需要公司file h1b amendment, 新的lca之类的。谢
谢!
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p*a
9
不可能阿
刘寨南是真正的亲兄弟阿
而且一无利益冲突,二无人对刘黄袍加身

【在 a***g 的大作中提到】
: 这话说的,“这样也好,希望咱们善始善终。”
: 以后陈主任会不会火拼刘宅男

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g*p
10
3mg的蛋白已经很多了,怎么可能不够你长晶体
又不是做nmr,不需要那么高的浓度的
离心不下来的基本都是细胞死掉了
因为Se-Met的毒性外加你的minimum medium的缘故
另外就是S->Se导致极性变弱了
水溶性太差
达到过饱和的浓度也比原来低了
把你的蛋白浓度稍微继续降低点

【在 y****l 的大作中提到】
: 大家好,我最近拿到了一个十二个跨膜结构膜蛋白的晶体,正在做SeMet标记晶体。
: 我用的菌株是:B834(DE3)
: 培养基:M9+19个氨基酸+0.5%glycerol+ 5%glucose +Thiamine+1mM MgSO4+0.1mM
: CaCl2+0.05mg/ml selenomethionine+amp
: 温度:37°
: 培养时间:24小时
: 用这样的方法,没4L菌可以大概拿到3毫克的蛋白。
: 现在问题是3毫克蛋白根本不够我用来长晶体。
: 问题:
: 1.在养细胞的时候我发现离心以后上清还是很浑浊,还有大量的菌在上清中无法被离下

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J*X
11
我的理解是需要的。我刚relo,还是同样的公司,同样职位。但是就需要h1b amendment
.只要file了就可以上班,不用等批准。

【在 I*******a 的大作中提到】
: 谢谢楼上的。
: 我的意思是除了这个换地址,是否需要公司file h1b amendment, 新的lca之类的。谢
: 谢!

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p*a
12
可达是否也有mit卧底?连中南海掼茶杯的道道都清楚
想明末,是不是解决祖大寿,小新的唯一法子就是御驾亲征了?
崇祯带大军直抵锦州,然后当面拿下问斩,否则永远没戏阿
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s*e
13
0.2mg/L se-met的飘过
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I*a
14
work from home 和relocation 应该不同,因为公司在这里根本没有office。
所以挺困惑的。
谢谢。

amendment

【在 J***X 的大作中提到】
: 我的理解是需要的。我刚relo,还是同样的公司,同样职位。但是就需要h1b amendment
: .只要file了就可以上班,不用等批准。

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M*G
15
崇祯是被迫害妄想狂的阳痿小孩儿,妄想九千岁要杀他,九千岁最后都示弱告老他还不
放心……
所以陈圆圆他都不太阳……
所以他要砍老袁……
所以他没种亲征怕丘八砍他……

【在 p********a 的大作中提到】
: 可达是否也有mit卧底?连中南海掼茶杯的道道都清楚
: 想明末,是不是解决祖大寿,小新的唯一法子就是御驾亲征了?
: 崇祯带大军直抵锦州,然后当面拿下问斩,否则永远没戏阿

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s*e
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Se-Met和WT几乎就是两个蛋白,十几个突变在那里,性质不一样很正常,应该重新
screen生长条件,不能抱住WT的条件不放手。
DDM都出沉淀的话确实不是好兆头,你如果在室温下长晶体的话应该试试4C
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m*r
17
我现在也有同样的问题,请问你是怎么解决的?非常感谢你的回复!

【在 I*******a 的大作中提到】
: 搬家到外州,公司同意work from home, 需要通知移民局吗?
: 谢谢。

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i*h
18
九千岁最后不踩上一脚才傻叉呢
很好的剩余价值干嘛不利用

【在 M*****G 的大作中提到】
: 崇祯是被迫害妄想狂的阳痿小孩儿,妄想九千岁要杀他,九千岁最后都示弱告老他还不
: 放心……
: 所以陈圆圆他都不太阳……
: 所以他要砍老袁……
: 所以他没种亲征怕丘八砍他……

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F*2
19
3mg的蛋白够你set up不少tray了吧。。。
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m*9
20
mark
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M*G
21
杀老九不是错,杀得这么蠢就不可原谅了~

【在 i***h 的大作中提到】
: 九千岁最后不踩上一脚才傻叉呢
: 很好的剩余价值干嘛不利用

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a*g
22
九千岁不是说自杀的么
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m*y
23
一代没事儿,保不齐最后学宋江拉李逵喝酒。
“兄弟,不带你走不放心啊。你是不会造反了,我家里那孽畜也是你看着长大的,可说
不定三胖就拿你硬盘里苍老师全集说事儿,到时候把你严打了,反坏了一世基友,不如
善始善终,一块上路吧……”

【在 p********a 的大作中提到】
: 不可能阿
: 刘寨南是真正的亲兄弟阿
: 而且一无利益冲突,二无人对刘黄袍加身

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m*y
24
看样子岁数偏大,没有与时俱进,崩衬衣扣子:)

【在 p********a 的大作中提到】
: 可达是否也有mit卧底?连中南海掼茶杯的道道都清楚
: 想明末,是不是解决祖大寿,小新的唯一法子就是御驾亲征了?
: 崇祯带大军直抵锦州,然后当面拿下问斩,否则永远没戏阿

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m*s
25
三胖真狠啊!摄政王太烂了。

【在 m***y 的大作中提到】
: 一代没事儿,保不齐最后学宋江拉李逵喝酒。
: “兄弟,不带你走不放心啊。你是不会造反了,我家里那孽畜也是你看着长大的,可说
: 不定三胖就拿你硬盘里苍老师全集说事儿,到时候把你严打了,反坏了一世基友,不如
: 善始善终,一块上路吧……”

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y*n
26
据说是二胖遗诏。弥留之际,金正日拉着儿子的手,断断续续说出最后的话:“儿子,
牢记三件事,坚持主体思想,继续发展核武,不要辜负。。。

【在 m*****s 的大作中提到】
: 三胖真狠啊!摄政王太烂了。
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m*s
27
保不准下一个是三胖的大哥二哥。
这跟以前争王位真的是一样一样的。

【在 y*****n 的大作中提到】
: 据说是二胖遗诏。弥留之际,金正日拉着儿子的手,断断续续说出最后的话:“儿子,
: 牢记三件事,坚持主体思想,继续发展核武,不要辜负。。。

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A*l
28
大哥不是在天朝么……
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