q*0
2 楼
用CO-immunoprecipitation (CO-IP)研究两个蛋白的相互作用, 作IP时,请问增加cell
lysate的量,或cell lysate与抗体-beads 的incubate时间会增加IP的阳性程度吗?
Thanks a lot!
lysate的量,或cell lysate与抗体-beads 的incubate时间会增加IP的阳性程度吗?
Thanks a lot!
w*a
4 楼
lysate多了,效果是好些
关于ab和beads,我一般过夜,2个小时也做过,感觉过夜好些,不是很确定。
个人经验,抛砖引玉。
关于ab和beads,我一般过夜,2个小时也做过,感觉过夜好些,不是很确定。
个人经验,抛砖引玉。
V*n
5 楼
理论上都能增加阳性程度,但也可能增加假阳性。俺的经验,供参考。
1)增加lysate,同时增加incubation volume(相当于保持蛋白浓度不变,或者降低
蛋白浓度),有助于降低non-specific
2)incubation时间不要过长,若干小时,最长过夜吧
3)最后清洗充分
1)增加lysate,同时增加incubation volume(相当于保持蛋白浓度不变,或者降低
蛋白浓度),有助于降低non-specific
2)incubation时间不要过长,若干小时,最长过夜吧
3)最后清洗充分
q*0
6 楼
Thank you very much! Very helpful!
d*y
7 楼
增加lysate的量, 抗体的量也可能需要相应增加才行.
w*a
9 楼
增加lysate,又增加体积,结果和都不增加一样。
增加lysate,过夜incubate,洗的时候加大盐浓度和detergent浓度,votex几下,要洗
的negative ctrl没了。
不过关键还是抗体,最好是over expressing,用一些常用tag。
如果是endogenous互相pull down,需要很好的抗体才行,抗体不好,就是有相互作用也
做不出来。
如果觉得可能性很大,gst pull down吧,这个比ip靠谱。
【在 V********n 的大作中提到】
: 理论上都能增加阳性程度,但也可能增加假阳性。俺的经验,供参考。
: 1)增加lysate,同时增加incubation volume(相当于保持蛋白浓度不变,或者降低
: 蛋白浓度),有助于降低non-specific
: 2)incubation时间不要过长,若干小时,最长过夜吧
: 3)最后清洗充分
增加lysate,过夜incubate,洗的时候加大盐浓度和detergent浓度,votex几下,要洗
的negative ctrl没了。
不过关键还是抗体,最好是over expressing,用一些常用tag。
如果是endogenous互相pull down,需要很好的抗体才行,抗体不好,就是有相互作用也
做不出来。
如果觉得可能性很大,gst pull down吧,这个比ip靠谱。
【在 V********n 的大作中提到】
: 理论上都能增加阳性程度,但也可能增加假阳性。俺的经验,供参考。
: 1)增加lysate,同时增加incubation volume(相当于保持蛋白浓度不变,或者降低
: 蛋白浓度),有助于降低non-specific
: 2)incubation时间不要过长,若干小时,最长过夜吧
: 3)最后清洗充分
w*n
10 楼
protein-protein interaction 我只相信细胞内超表达的IF数据。
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