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再问protein purification,Glutathione Sepharose 4B binding
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再问protein purification,Glutathione Sepharose 4B binding# Biology - 生物学
i*n
1
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z*n
2
了解福德
西藏德格有一個小王國,這個皇室的血脈在大約一個世代以前中斷了,所以現在已
經沒有德格皇室的後裔。大家都相信,德格一位非常重要的國王曾是偉大的西藏上師蔣
揚欽哲旺波的弟子。
曾有預言說,當他們兩人舉辦大法會時,蔣揚欽哲旺波應該要在法會當中把德格王
痛打一頓。時至今日,德格人甚至還會說,由於德格人沒有福報,所以那一天,德格王
的表現好到蔣揚欽哲旺波找不到打他的理由。因為根據那個預言,如果蔣揚欽哲旺波在
那天狠打了德格王,德格王室就能持續的傳承下去。
我之所以告訴你們這個故事,是因為這是了解「福德」的另一種方式。「福德」的
概念是非常廣大的。在佛教的某些派別裡,比如聲聞乘,他們沒有大乘佛教徒所討論的
有關「佛性」的概念,他們只談「福德」。
我發現有關「福德」的詮釋混合了許多文化上的差異。有人問過我:「累積福德不
是很自私嗎?」這是很有意思的問題。作為佛陀的追隨者,我們難道不是應該除去對任
何事物的執著嗎?我們怎麼會有積聚、儲存「定期存款」的這種心態呢?我們怎麼能夠
投資福德?
在討論這些問題以前,我們先談談「福德」的重要性,它的功能,以及它的作用。
「福德」或藏文的「康亞」只是個名稱、標籤。剛才我提到,許多人認為「運氣」
只是必然會發生的偶然事件,但「福德」不是如此。「福德」的道理其實是「業力」原
則最高且最細微的面向之一。
如同我常講的,「業力」要比「空性」難教。你可以概括的說,「業」就是因、緣
、果。舉例來說,如果你種花,一旦把種子、肥料、土壤、水分、時間和空間等所有這
些因素湊在一塊兒,假使又沒有任何障礙,花一定會綻放;在這種層次上了解因果還算
容易。不過,一旦它涉及了某種隱含的因素,譬如你用同樣的種子種了十朵花───不
只是一粒種子,而是十粒完全相同種類的種子───當其中一粒種子表現得不太一樣時
,我們就必須更深入的探究。
你對這些種子的照顧完全相同,可是這粒種子的表現就是不一樣,因此你進一步探
究:也許這粒種子的前二代種子,因某個特殊事件而影響了它的基因。當我們開始探索
更多隱藏的因素,有些人就從這裡開始變成宿命論者,有些人變成虛無主義者、科學家
、有神論者、無神論者等等。
福德可以被創造
根據佛教的理論,福德是可以由你去創造、捏造、積聚的東西。
假設你有兩個小孩,一個很懶惰,幾乎沒受什麼教育,書又念得不好,家事也不行
;而另一個則是恰恰相反。可是他們長大後,你不抱任何希望的那個懶孩子,卻比較成
功。這種事情經常發生。如果你問佛教徒,他們會說這是福德使然;或者他們可能會先
說,這是業力的緣故。
這麼說有點危險,因為許多人接著會想:「所以這就是我的命嗎?我不能改變它嗎
?」很多時候當人們聽到佛教徒對「業」的解釋,他們的想法常是這樣。
假設某人有六個鼻子,你不能說:「他無法擺脫他有六個鼻子的業。」這不是佛教
徒對「業」的詮釋。業力不是要這個人不斷的想:「我擺脫不了這六個鼻子,我改變不
了這種情況。」
這一點很重要。「業」是你可以自己創造的;這意味著,如果你想要再多一個鼻子
,你可以作整型手術,尤其如果「七」還是個幸運數字!了解「業」是非常重要的一件
事。
共同的福德
我現在要講得再複雜一點。有個東西我們稱之為「共業」,或者「共同的福德」。
舉例來說,我們不知道我們有何種福德或沒有何種福德,所以某一位總統參選人會當選
。我們都不知道。
身為世界的公民與另一個國家的公民,我很關心這件事。因為我還是認為,美國總
統在這世界上扮演一個很重要的角色。就連非美國人,也需有足夠的福德才能讓美國選
出一個好總統。
福與非福
當我們講到福德,我們討論的對象不單是一些很重大的事情,它也可能是看似微不
足道的俗事;這完全是相對的。
譬如說你開車到某個地方並且順利抵達,可是你卻沒有福氣把車停好,你到處找都
找不到車位。如果本來把車停好後,你的約會將帶給你一些美好的時光,結果只因為找
不到停車位而一切都毀了───這就是「缺乏福德」。
不過,假設說,正當你一直找不到停車位,開車到處轉的時候,你本來要進去的那
棟大樓突然崩塌了───是因為你的「福德」,所以找不到車位。
福德的相對性
福德確實在每一件事情上都扮演了重要的角色:我們的人際關係、經濟、政治、日
常的世俗生活,甚至你說話的語調。從許多方面來看,它也是非常相對的。
從中古世紀到現在,我們也許可以說因為我們擁有好的福德,所以我們有 iPhone
這樣的手機;我們不必走老遠的路去跟某人講話,打個電話就行了。
不過從另一個觀點來看,像密勒日巴那樣的人應該會同意,正因為我們缺乏福德,
所以生在這樣物質主義的時代。
福德帶你接近實相
佛法的參照點永遠是某件事情是否更接近實相真理,因此,任何帶你更接近實相的
,就是福德的行為;任何帶你遠離實相的,就是缺乏福德。它的範圍可以從看起來很小
的事情一直到非常重要的事情。
我現在是以佛教徒的身分來說,身為佛教徒,我們會說,因為我們共同的福報,所
以我們投生在一個仍有「佛、法、僧」概念的時代和地點,或至少仍有「佛」的概念。
所謂缺乏福德可能小至當一個老師正要傳授深奧的教法時,你打盹了半秒鐘,或者有人
咳嗽,以致於你沒聽到。
基本上,任何帶你趨近實相的行為或情境,就是「福德」。那麼我們需要怎麼做呢
?修行之道因而鋪展出來。因為我們需要更接近實相,任何帶我們越接近實相的事,我
們要試著去作;任何帶我們遠離實相的事情,我們儘量避免。
積聚福德的三種訓練
現在我要告訴各位三種積聚福德的方法。這三個非常基本而重要的訓練藏文稱為「
拉巴」,我把它們的順序倒過來講。
一、 智慧的訓練
第一個訓練是「拉巴西惹」───智慧的訓練,智慧的訓練會幫助你們了解(我剛
才所講的)無常及其他許多實相。擁有智慧,你就更能體會、欣賞這些實相。為了累積
智慧,我們透過像是聞、思、修等方法來積聚一些因和緣。
舉例來說,去參加討論實相的課程,在這裡,我們不是指科學上的事實,或者什麼
食物適合或不適合吃,我們討論的不是這種事實。我們指的是能夠根除痛苦、生起智慧
的事實,那才是我們需要的───智慧的訓練。
要訓練智慧,你必須習慣所謂「開放的心胸」,你必須慢慢的、慢慢的放掉一切顧
忌。如果你仍受文化、種族、某種思惟、性別或像是佛教、印度教諸如此類的「教」或
「主義」的束縛,為了擁有智慧,你就必須超越這一切,你必須創造開放的態度。
但這有點困難,你知道為什麼難嗎?因為你要不斷對你自己下的結論保持懷疑的態
度。我要說的是,你必須在謙卑和自信之間找到平衡,而這兩者的平衡並不容易。
當你研讀佛教哲學時,可能聽過:佛教是最批判、最多疑的哲學系統,它是最無神
論的哲學系統。佛教分析辨理的目的與否定一切的虛無主義沒有一點關係,否定一切不
是佛教的目的。不過,你真的必須試著超越所有文化上的束縛。這很難,因為所謂的「
客觀」其實還是「主觀」;你終將只選擇你信任的人,所以實際上,作決定的人仍是你。
我們來簡要的談一下智慧。典型的佛教智慧是:一切都是空性,同時,外顯沒有任
何障礙。
我舉個例子,如果你看著鏡子,會看到你自己的臉在鏡子裡。鏡子裡的臉並不真實
存在,它不是你的第二張臉,它不是真實的。但問題是,只有你的臉會反射在鏡子裡,
當你看鏡子時,你看到的只有你的臉,而不是一個杯子、一本書,或任何其他東西。可
能有人會想,假如這是幻覺,那麼反映出來的東西就應該是一團混亂。可是,它卻井然
有序。
如果你移動你的臉,它也跟著動,這讓你忘了它是不真實的。基本上,根據佛法,
這就是一切事物(萬事萬物)運作的方式。對你們來說,我坐在你們面前;對我來說,
你們坐在我面前。這就像鏡子裡的反射───空與顯同時存在。因為我們談到了智慧,
所以我提起這個例子。討論智慧並不容易。
二、 三摩地禪定的訓練
第二個訓練是三摩地禪定。禪定是累積福德的另一種訓練或另一種方法。禪定會帶
你接近實相,但不是所有類形的禪定都可以。我們講的不是欣賞夕陽的這種禪定。近來
,大家把欣賞落日餘暉、聆聽貝多芬伴隨鳥兒啁啾的音樂,當作是禪定。
只有以智慧為基礎的禪定,才能視為帶你接近實相的禪修;「夕陽禪定」不會帶你
趨近實相。在這裡我要小小顛覆你們。現在我常聽到,很多人偷了佛教的這些點子:「
不要回想過去,不要臆測未來,安住在當下。」他們卻沒有把功勞歸給佛陀或佛弟子們
對「當下」的討論。
各位知道嗎,就算你擅於不住過去、不住未來、安住當下,假使你不了解空與顯,
「當下禪定」就如同「夕陽禪定」一樣沒有用;我是說真的。不過當然,這樣的說法聽
起來很有異國情調,很深奧。「安住當下」,哇,聽起來很棒!當然囉!可是如果你不
了解空與顯,它就完全沒用!
為什麼要安住當下呢?而且,事實上根本沒有「當下」這個東西,它完全是假的。
首先,從究竟上來說,佛教徒不相信時間;「當下」是時間,所以它也不存在。其實我
會說,「夕陽禪定」還比較好,至少它給你一點憂傷的感覺,你可能還能曬一身黑亮的
皮膚。所以,禪定的訓練必須有一個好的、完整的道路。
要成為合格的創造福德的機器,禪定的訓練必須與第一個訓練───智慧的訓練─
──不相衝突。我之所以說這些,是因為我們往往被禪修的種種儀式轉移了注意力,以
為那比了解智慧重要。我們喜歡那些規矩,比如身體坐直,至少這是我們可以感知到。
這裡順帶一提一些佛教典型的禪修。
在眾多禪定的方法裡,有兩個是「止」和「觀」,相信你們已經聽說過上千萬遍,
所以我用幾句話作個概要的解釋。基本上,「止」是個詭計,而「觀」是生意。為了要
做生意,你需要這些詭計;因此「止」和「觀」都是必要的。
寂天大師剛出現在我腦海裡,所以我想我得提一下我想到了什麼。根據那些偉大的
大乘導師們,佛陀好比是個醫生,我們如同生病的人,我們有情緒煩惱的疾病。當你生
了一般的疾病時,比如頭痛,就只有你受苦;可是當你有情緒煩惱的疾病時,不只你受
苦,你同時讓別人也受苦。這其實是摘自寂天所說的話。
對於一般的疾病,我們有許多藥物可用。當我到藥房買藥,光是治療頭痛的藥就有
很多,治療情緒煩惱的藥卻極為稀少;事實上,只有佛陀才有。也許這話說得有點太過
分。許多靈性修道,比如印度教,也討論能去除這個情緒之病的藥方。許多修道提到像
是「愛你的鄰居」等方式,但只有佛陀提到去除情緒煩惱的因,也就是去除我執。這就
是為什麼它如此的稀有。只有佛的教法能對治這種病,禪定的訓練是佛所開的藥方。
我最近才了解到,從佛教的觀點嚴格來看,當今人們所謂的「禪定」,多數根本不
算是「三摩地」。大部分人以為,身體打直、緩慢呼吸、不要移動,這就是禪定;那不
一定是禪定,那只是身體坐直。
對於禪定,一個比較嚴謹的藏文用語是「釀札」。「釀」的意思是平等,「札」是
不打擾、不碰觸、順其自然。我對《道德經》十分推崇,它開頭短短幾句就說了許多關
於順其自然的道理。一切事物皆平等,沒有所謂的好、壞、對、錯、左、右,沒有這些
;一切事物皆平等,所以順其自然。不管你是坐直、倒立、躺下、在吊床上搖擺,或在
墨西哥度假勝地啜飲龍舌蘭酒,只要你可以做「釀札」───平等、順其自然,你就是
真正在修禪定。
三、 戒律的訓練
最後是第三個戒律的訓練,這點很重要。如同三摩地的訓練,戒律的訓練也必須與
智慧有關。如果你的戒律與智慧無關,不論你做什麼───像繞行多次,用繩索將你的
身體完全綑綁起來───都不是我們這裡所談的戒律。
我們討論的是福德,所以我講的是積聚福德的方法,戒律和智慧不相衝突,這點很
重要。彌勒菩薩說,一個持戒的人心裡想:「噢,我的戒律持守得很好。我凌晨四點鐘
起床,不吃鴕鳥肉,我不殺蟑螂反而收養他們……」如果你以此為傲,你守的戒律與智
慧無關,這種戒律會使你變得像清教徒似的嚴肅而拘謹。
如果你變得嚴肅拘謹,你會有兩種「情結」。當你走在紐約蘇活區,你會有優越情
結,例如你看到妓女,你產生優越感,因而瞧不起她們。當你在路上看到耆那教的僧侶
,你會產生自卑情結。自卑感不是謙卑,它基本上像是憤怒,你會努力在耆那教僧侶的
身上挑毛病。
我們佛教徒常常做這種事,也許不該說我們,實際上是我常常做這種事。我覺得耆
那教那麼好,不知道為什麼它沒能在這世界上興盛起來。當我看見耆那教的出家人,我
立即的反應是:「他們沒有智慧,他們沒有空性和明覺。」而不是去欣賞他們瑣碎而狂
熱式的堅守非暴力原則。
狂熱式的非暴力,你們聽過這種說法嗎?舊金山有耆那教的中心嗎?你們應該上網
查查。聽說美國東岸有他們的中心,加州的這些比基尼可能對耆那教的僧侶來說多得難
以招架。
發誓受戒
我們再回來談「戒律」。任何事都可以當作是戒律。通常的建議是你自己規範自己
,而不是別人強迫你,不過你可以選擇去要求某個人給你戒律。你知道這稱為什麼嗎?
這就叫作「誓言」。
誓言可以是任何事。它可以是個很可悲的誓言,像新年願望之類的;也可以是吃完
很大一份義大利麵之後,立即產生的罪惡感:「從明天開始,我再也不吃義大利麵了。
」但是到了明天,你又吃了,然後你產生更多的罪惡感───一種「充滿罪惡感的誓言
」。
持有某種戒律來發展三摩地禪定,並進而發展智慧,這是必要的。假使這個戒律的
訓練還能利益他人,那更好,在大乘佛教裡尤其如此。
我要跟你們說,不要瞧不起微小的行為。也許我們沒有能力發一個像是「不殺鴕鳥
」的誓言,但你有力量發誓,刷牙時把水龍頭關上而不浪費水───你可以發這種誓言。
問題是,我們許多人認為這個誓言那麼微不足道。「我們不要發那種誓言,我們要
試著發些比較大的誓言,比如不要有性行為。」那樣的誓言就很難了!就算只是每個星
期三不要有性行為都很難,有時你會忘記。
不過老實告訴各位,我發現,連刷牙時關上水龍頭都並不容易。我們許多人會認為
這樣的小事和靈修的道路無關。關掉水龍頭?這有何靈性可言?其實這個戒律算不算是
靈修,完全在於你的動機,端看你多有創意。
如果你是菩薩,曾經受過菩薩戒,並且發過誓,每一次刷牙的時候都要關掉水龍頭
,這個行為就會利益眾生。這不只能幫助他們證悟,也有益於生態環境,還能幫助人類。
受戒或發誓是一個積聚福德資糧的好方式。比如說,現在,你我沒有到處殺人。我
們這樣沒有殺人已經過了多少年?我們沒去殺人其實只是因為我們沒有那個膽量,沒有
時間,沒有力氣,也沒有理由去殺人。
殺人要花很多時間,如果你殺人,就得花大量的時間在這件事情上───之前、之
後、和中間的過程。可是我們這樣有累積福德嗎?沒有。我們沒有累積殺人的惡業,也
沒有累積不殺人的善業;我們只是懶惰。
佛教積聚福德的方法非常巧妙,一個簡單的行為就可以積聚大量的福德。假設你一
開始就發誓不殺人,一旦發了誓,即使你在睡覺,因為你在睡覺時沒有殺任何人,所以
你分分秒秒都在累積福德。這是真的!所以如果你想要累積福德資糧,就得發誓。
其他積聚福德的方式
其他積聚福德的方式包括:做大禮拜,以粉碎傲慢;做供養,以對治慳吝;發露懺
悔不端的行為,以摧毀我執藏匿或築巢之處;隨喜他人善行,以對抗嫉妒;為了對抗錯
誤的知見,我們做兩件事───請上師轉法輪或開示,以及請上師住世;然後回向福德
。所以這應該回復了先前的問題:「積聚福德資糧是否太自私?」答案是否定的,自私
的「我」因為智慧已經消失了。
我要以兩段話作結論。佛法的道路有兩項挑戰,第一個是,有關實相的科學和哲學
在智識上非常難理解;第二個是,真正的相信───不是哲學討論的實相,而是實相本
身───是如此簡單,簡單到讓我們難以信任。
你們會有這兩項挑戰,第一個挑戰很容易,你可以閱讀書籍,問有關佛法的問題,
只要你能這樣做,你就會有進步。第二個挑戰很困難,這個挑戰在於「簡單」。你不能
閱讀書籍,沒有人能教你,你越問就越糊塗;解決之道在於「福德」。當你具足福德,
甚至聽到嬰兒的哭鬧聲,你會去想「噢,這就是了。」這整個世界也許會認為你是個白
痴,但誰在乎呢?所謂「什麼都不在乎」其實是對證悟一個相當好的描述。
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n*s
3
我有一个屏幕是用executive assistant的4x4 widget,然后每次转到那个屏幕,就能
看到数量不等的彩色横条在屏幕上,每次位置不一定一样
这个看着又不像屏幕的硬件问题,因为转到别的页的时候就没有。貌似这个也不是
assist的问题。最开始有google search widget的时候,也偶尔能看到这样的问题
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n*w
4
最近用GST beads,有个疑问,
bacteria pellet我没有用PBS dissolve,而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
N-lauroylsarcosine,25mM TEA和
1mM EDTA (pH 8.0)。
最近发现binding有些问题,因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
别就是target protein少了,这个我
没有观察到。
我在想到底是哪个地方出了问题。
有经验的同学指点一下~谢谢!
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W*d
5
Call and tell them your applications are not the same (personal vs. business
). That's how my friend got his approval.

【在 i****n 的大作中提到】
: Thank you for applying for a Business Card account. We
: are unable to approve your application at this time because
: of the following:
: o You have submitted multiple applications for credit.
: This is what I got from CITI. I already had two personal cards at the
: beginning of Nov and I was trying to apply this business card after 60
: days. Does anyone know how long I have to wait?

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c*r
6
我的有同样的毛病。而且还有 dust accumulating underneath the LCD screen.
need to get a replacement in Costco.

【在 n*****s 的大作中提到】
: 我有一个屏幕是用executive assistant的4x4 widget,然后每次转到那个屏幕,就能
: 看到数量不等的彩色横条在屏幕上,每次位置不一定一样
: 这个看着又不像屏幕的硬件问题,因为转到别的页的时候就没有。貌似这个也不是
: assist的问题。最开始有google search widget的时候,也偶尔能看到这样的问题

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T*O
7
Is your pH accurate? Is your pH meter calibrated properly?
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i*n
8
Thanks! Will do!

business

【在 W*****d 的大作中提到】
: Call and tell them your applications are not the same (personal vs. business
: ). That's how my friend got his approval.

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l*a
9
你试试看这样操作,我把屏幕显示彩条的widget删除了以后,重新加了个一样的widget
,然后彩条到现在都没有再出现。。。实在不明白为啥会这样,不过倒是看起来解决了
问题了
那个ldc下面dust的问题我估计怎么换机器都没用。。。htc那个后盖设计的方式就让
lcd周围很轻易暴露出来,你压一压边上,非常明显的能感觉到变形

【在 c*****r 的大作中提到】
: 我的有同样的毛病。而且还有 dust accumulating underneath the LCD screen.
: need to get a replacement in Costco.

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n*w
10
我这个solution没有测pH,这个也是我在想的一个问题,我要不要用PBS来配这个
buffer,然后将pH调到7.3。
我试一下明天。

%

【在 n***w 的大作中提到】
: 最近用GST beads,有个疑问,
: bacteria pellet我没有用PBS dissolve,而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
: N-lauroylsarcosine,25mM TEA和
: 1mM EDTA (pH 8.0)。
: 最近发现binding有些问题,因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
: 别就是target protein少了,这个我
: 没有观察到。
: 我在想到底是哪个地方出了问题。
: 有经验的同学指点一下~谢谢!

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i*n
11

business
I just called them and they told me that I have to wait for three months
after last application. I thought it was two months. Do you know it's two
or three months?

【在 W*****d 的大作中提到】
: Call and tell them your applications are not the same (personal vs. business
: ). That's how my friend got his approval.

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d*e
12
顺便问一下这个手机信号怎么样? 看到有人抱怨这个问题。 现在的手机室内信号不好
,整怕了, 正想升级一个,
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h*b
13
为啥用lauroylsarcosine ? 这东西好像对珠子不好吧。ionic detergent,而且对你的
蛋白也不好啊。

%

【在 n***w 的大作中提到】
: 最近用GST beads,有个疑问,
: bacteria pellet我没有用PBS dissolve,而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
: N-lauroylsarcosine,25mM TEA和
: 1mM EDTA (pH 8.0)。
: 最近发现binding有些问题,因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
: 别就是target protein少了,这个我
: 没有观察到。
: 我在想到底是哪个地方出了问题。
: 有经验的同学指点一下~谢谢!

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n*w
14
Because most of my protein is in inclusion bodies and I don't wanna directly
go to the last resort dissolving
with guanidine hydrochloride, I found a protocol using this detergent to
increase the production of soluble
protein.
I know nothing about its physical chemical properties and I haven't thought
about the impact of this
ingredient.
Thanks.

【在 h*****b 的大作中提到】
: 为啥用lauroylsarcosine ? 这东西好像对珠子不好吧。ionic detergent,而且对你的
: 蛋白也不好啊。
:
: %

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m*5
15
最明显的应该是beads上蛋白拿到一大堆
蛋白产量高的话轻易就能饱和beads,很难看出来的
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C*e
16
虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
但是好像pH 7.4是最佳binding
tech support的人也这么说
说buffer什么的不重要
重要的是pH
你的bead会不会饱和了?
然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
表达的还挺多
然后跟我的融合蛋白竞争
很容易就把柱子饱和了
哦,还有一个
你提到你的蛋白是inclusion body
我没用过N-lauroylsarcosine
如果好用的话回头汇报一下哈
不过我遇到inclusion body的时候用过Pierce的B-PerII
很好使
结果大部分都变成可溶了
当然我的那个例子比较极端
光用sonication是大多数都在pellet里
用B-PerII加sonication以后大多都在上清里
我一升的e.coli居然提了快100 ug的蛋白

%

【在 n***w 的大作中提到】
: 最近用GST beads,有个疑问,
: bacteria pellet我没有用PBS dissolve,而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
: N-lauroylsarcosine,25mM TEA和
: 1mM EDTA (pH 8.0)。
: 最近发现binding有些问题,因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
: 别就是target protein少了,这个我
: 没有观察到。
: 我在想到底是哪个地方出了问题。
: 有经验的同学指点一下~谢谢!

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b*n
17
100 ug/L的产量好像少了点,是不是蛋白有毒性或者太大?

【在 C*******e 的大作中提到】
: 虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
: 但是好像pH 7.4是最佳binding
: tech support的人也这么说
: 说buffer什么的不重要
: 重要的是pH
: 你的bead会不会饱和了?
: 然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
: 表达的还挺多
: 然后跟我的融合蛋白竞争
: 很容易就把柱子饱和了

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n*w
18
嗯,有可能饱和了。
我昨天把1st binding后的supernatant又加beads了,看好没好些今天。
我觉得N-lau还是挺好使的。能solubilize大部分pellet。
我500ml的culture提了差不多160ug的蛋白。。。
我下次买点你说的B-Per试试好了~ (不过看成分也差不多)
我现在的protocol基本上是:(For 500ml culture)
1. thaw pellet on ice
2. add 18ml GST buffer (配方见上),add 1% PI, add 2ml lysozyme (10mg/ml),
mix on ice for 30 seconds
3. pass thru 20G syringe to reduce viscosity, also add DNAse 40ul (1mg/ml).
4. sonication (it will become clear)
5. 10000rpm, 40min,4deg
6. collect supernatant for GST beads binding
不过我这次还是将GST buffer的pH调到了7.4左右。不调的话差不多是9左右。

【在 C*******e 的大作中提到】
: 虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
: 但是好像pH 7.4是最佳binding
: tech support的人也这么说
: 说buffer什么的不重要
: 重要的是pH
: 你的bead会不会饱和了?
: 然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
: 表达的还挺多
: 然后跟我的融合蛋白竞争
: 很容易就把柱子饱和了

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C*e
19
昨天晚上稀里糊涂吧单位打错了
是一升提了100 mg

【在 b******n 的大作中提到】
: 100 ug/L的产量好像少了点,是不是蛋白有毒性或者太大?
avatar
C*e
20
记下了
谢谢!
下次要试试看。

(1mg/ml).

【在 n***w 的大作中提到】
: 嗯,有可能饱和了。
: 我昨天把1st binding后的supernatant又加beads了,看好没好些今天。
: 我觉得N-lau还是挺好使的。能solubilize大部分pellet。
: 我500ml的culture提了差不多160ug的蛋白。。。
: 我下次买点你说的B-Per试试好了~ (不过看成分也差不多)
: 我现在的protocol基本上是:(For 500ml culture)
: 1. thaw pellet on ice
: 2. add 18ml GST buffer (配方见上),add 1% PI, add 2ml lysozyme (10mg/ml),
: mix on ice for 30 seconds
: 3. pass thru 20G syringe to reduce viscosity, also add DNAse 40ul (1mg/ml).

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n*w
21
哇。。。
还有就是我这次的GST buffer是用PBS配的,不是用水,也许有些salt的成分比较好把~
谢谢包子~

【在 C*******e 的大作中提到】
: 昨天晚上稀里糊涂吧单位打错了
: 是一升提了100 mg

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v*a
22
请教一下 B-PER和Y-PER区别大吗?
我用BL21(DE3),可以用Y-PER提吗?

【在 C*******e 的大作中提到】
: 虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
: 但是好像pH 7.4是最佳binding
: tech support的人也这么说
: 说buffer什么的不重要
: 重要的是pH
: 你的bead会不会饱和了?
: 然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
: 表达的还挺多
: 然后跟我的融合蛋白竞争
: 很容易就把柱子饱和了

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