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再问protein purification，Glutathione Sepharose 4B binding

再问protein purification，Glutathione Sepharose 4B binding# Biology - 生物学

i*n2011-04-20 07:04

1 楼

Thank you for applying for a Business Card account. We
are unable to approve your application at this time because
of the following:
o You have submitted multiple applications for credit.
This is what I got from CITI. I already had two personal cards at the
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days. Does anyone know how long I have to wait?

z*n2011-04-20 07:04

2 楼

了解福德
西藏德格有一個小王國，這個皇室的血脈在大約一個世代以前中斷了，所以現在已
經沒有德格皇室的後裔。大家都相信，德格一位非常重要的國王曾是偉大的西藏上師蔣
揚欽哲旺波的弟子。
曾有預言說，當他們兩人舉辦大法會時，蔣揚欽哲旺波應該要在法會當中把德格王
痛打一頓。時至今日，德格人甚至還會說，由於德格人沒有福報，所以那一天，德格王
的表現好到蔣揚欽哲旺波找不到打他的理由。因為根據那個預言，如果蔣揚欽哲旺波在
那天狠打了德格王，德格王室就能持續的傳承下去。
我之所以告訴你們這個故事，是因為這是了解「福德」的另一種方式。「福德」的
概念是非常廣大的。在佛教的某些派別裡，比如聲聞乘，他們沒有大乘佛教徒所討論的
有關「佛性」的概念，他們只談「福德」。
我發現有關「福德」的詮釋混合了許多文化上的差異。有人問過我：「累積福德不
是很自私嗎？」這是很有意思的問題。作為佛陀的追隨者，我們難道不是應該除去對任
何事物的執著嗎？我們怎麼會有積聚、儲存「定期存款」的這種心態呢？我們怎麼能夠
投資福德？
在討論這些問題以前，我們先談談「福德」的重要性，它的功能，以及它的作用。
「福德」或藏文的「康亞」只是個名稱、標籤。剛才我提到，許多人認為「運氣」
只是必然會發生的偶然事件，但「福德」不是如此。「福德」的道理其實是「業力」原
則最高且最細微的面向之一。
如同我常講的，「業力」要比「空性」難教。你可以概括的說，「業」就是因、緣
、果。舉例來說，如果你種花，一旦把種子、肥料、土壤、水分、時間和空間等所有這
些因素湊在一塊兒，假使又沒有任何障礙，花一定會綻放；在這種層次上了解因果還算
容易。不過，一旦它涉及了某種隱含的因素，譬如你用同樣的種子種了十朵花───不
只是一粒種子，而是十粒完全相同種類的種子───當其中一粒種子表現得不太一樣時
，我們就必須更深入的探究。
你對這些種子的照顧完全相同，可是這粒種子的表現就是不一樣，因此你進一步探
究：也許這粒種子的前二代種子，因某個特殊事件而影響了它的基因。當我們開始探索
更多隱藏的因素，有些人就從這裡開始變成宿命論者，有些人變成虛無主義者、科學家
、有神論者、無神論者等等。
福德可以被創造
根據佛教的理論，福德是可以由你去創造、捏造、積聚的東西。
假設你有兩個小孩，一個很懶惰，幾乎沒受什麼教育，書又念得不好，家事也不行
；而另一個則是恰恰相反。可是他們長大後，你不抱任何希望的那個懶孩子，卻比較成
功。這種事情經常發生。如果你問佛教徒，他們會說這是福德使然；或者他們可能會先
說，這是業力的緣故。
這麼說有點危險，因為許多人接著會想：「所以這就是我的命嗎？我不能改變它嗎
？」很多時候當人們聽到佛教徒對「業」的解釋，他們的想法常是這樣。
假設某人有六個鼻子，你不能說：「他無法擺脫他有六個鼻子的業。」這不是佛教
徒對「業」的詮釋。業力不是要這個人不斷的想：「我擺脫不了這六個鼻子，我改變不
了這種情況。」
這一點很重要。「業」是你可以自己創造的；這意味著，如果你想要再多一個鼻子
，你可以作整型手術，尤其如果「七」還是個幸運數字！了解「業」是非常重要的一件
事。
共同的福德
我現在要講得再複雜一點。有個東西我們稱之為「共業」，或者「共同的福德」。
舉例來說，我們不知道我們有何種福德或沒有何種福德，所以某一位總統參選人會當選
。我們都不知道。
身為世界的公民與另一個國家的公民，我很關心這件事。因為我還是認為，美國總
統在這世界上扮演一個很重要的角色。就連非美國人，也需有足夠的福德才能讓美國選
出一個好總統。
福與非福
當我們講到福德，我們討論的對象不單是一些很重大的事情，它也可能是看似微不
足道的俗事；這完全是相對的。
譬如說你開車到某個地方並且順利抵達，可是你卻沒有福氣把車停好，你到處找都
找不到車位。如果本來把車停好後，你的約會將帶給你一些美好的時光，結果只因為找
不到停車位而一切都毀了───這就是「缺乏福德」。
不過，假設說，正當你一直找不到停車位，開車到處轉的時候，你本來要進去的那
棟大樓突然崩塌了───是因為你的「福德」，所以找不到車位。
福德的相對性
福德確實在每一件事情上都扮演了重要的角色：我們的人際關係、經濟、政治、日
常的世俗生活，甚至你說話的語調。從許多方面來看，它也是非常相對的。
從中古世紀到現在，我們也許可以說因為我們擁有好的福德，所以我們有 iPhone
這樣的手機；我們不必走老遠的路去跟某人講話，打個電話就行了。
不過從另一個觀點來看，像密勒日巴那樣的人應該會同意，正因為我們缺乏福德，
所以生在這樣物質主義的時代。
福德帶你接近實相
佛法的參照點永遠是某件事情是否更接近實相真理，因此，任何帶你更接近實相的
，就是福德的行為；任何帶你遠離實相的，就是缺乏福德。它的範圍可以從看起來很小
的事情一直到非常重要的事情。
我現在是以佛教徒的身分來說，身為佛教徒，我們會說，因為我們共同的福報，所
以我們投生在一個仍有「佛、法、僧」概念的時代和地點，或至少仍有「佛」的概念。
所謂缺乏福德可能小至當一個老師正要傳授深奧的教法時，你打盹了半秒鐘，或者有人
咳嗽，以致於你沒聽到。
基本上，任何帶你趨近實相的行為或情境，就是「福德」。那麼我們需要怎麼做呢
？修行之道因而鋪展出來。因為我們需要更接近實相，任何帶我們越接近實相的事，我
們要試著去作；任何帶我們遠離實相的事情，我們儘量避免。
積聚福德的三種訓練
現在我要告訴各位三種積聚福德的方法。這三個非常基本而重要的訓練藏文稱為「
拉巴」，我把它們的順序倒過來講。
一、智慧的訓練
第一個訓練是「拉巴西惹」───智慧的訓練，智慧的訓練會幫助你們了解（我剛
才所講的）無常及其他許多實相。擁有智慧，你就更能體會、欣賞這些實相。為了累積
智慧，我們透過像是聞、思、修等方法來積聚一些因和緣。
舉例來說，去參加討論實相的課程，在這裡，我們不是指科學上的事實，或者什麼
食物適合或不適合吃，我們討論的不是這種事實。我們指的是能夠根除痛苦、生起智慧
的事實，那才是我們需要的───智慧的訓練。
要訓練智慧，你必須習慣所謂「開放的心胸」，你必須慢慢的、慢慢的放掉一切顧
忌。如果你仍受文化、種族、某種思惟、性別或像是佛教、印度教諸如此類的「教」或
「主義」的束縛，為了擁有智慧，你就必須超越這一切，你必須創造開放的態度。
但這有點困難，你知道為什麼難嗎？因為你要不斷對你自己下的結論保持懷疑的態
度。我要說的是，你必須在謙卑和自信之間找到平衡，而這兩者的平衡並不容易。
當你研讀佛教哲學時，可能聽過：佛教是最批判、最多疑的哲學系統，它是最無神
論的哲學系統。佛教分析辨理的目的與否定一切的虛無主義沒有一點關係，否定一切不
是佛教的目的。不過，你真的必須試著超越所有文化上的束縛。這很難，因為所謂的「
客觀」其實還是「主觀」；你終將只選擇你信任的人，所以實際上，作決定的人仍是你。
我們來簡要的談一下智慧。典型的佛教智慧是：一切都是空性，同時，外顯沒有任
何障礙。
我舉個例子，如果你看著鏡子，會看到你自己的臉在鏡子裡。鏡子裡的臉並不真實
存在，它不是你的第二張臉，它不是真實的。但問題是，只有你的臉會反射在鏡子裡，
當你看鏡子時，你看到的只有你的臉，而不是一個杯子、一本書，或任何其他東西。可
能有人會想，假如這是幻覺，那麼反映出來的東西就應該是一團混亂。可是，它卻井然
有序。
如果你移動你的臉，它也跟著動，這讓你忘了它是不真實的。基本上，根據佛法，
這就是一切事物（萬事萬物）運作的方式。對你們來說，我坐在你們面前；對我來說，
你們坐在我面前。這就像鏡子裡的反射───空與顯同時存在。因為我們談到了智慧，
所以我提起這個例子。討論智慧並不容易。
二、三摩地禪定的訓練
第二個訓練是三摩地禪定。禪定是累積福德的另一種訓練或另一種方法。禪定會帶
你接近實相，但不是所有類形的禪定都可以。我們講的不是欣賞夕陽的這種禪定。近來
，大家把欣賞落日餘暉、聆聽貝多芬伴隨鳥兒啁啾的音樂，當作是禪定。
只有以智慧為基礎的禪定，才能視為帶你接近實相的禪修；「夕陽禪定」不會帶你
趨近實相。在這裡我要小小顛覆你們。現在我常聽到，很多人偷了佛教的這些點子：「
不要回想過去，不要臆測未來，安住在當下。」他們卻沒有把功勞歸給佛陀或佛弟子們
對「當下」的討論。
各位知道嗎，就算你擅於不住過去、不住未來、安住當下，假使你不了解空與顯，
「當下禪定」就如同「夕陽禪定」一樣沒有用；我是說真的。不過當然，這樣的說法聽
起來很有異國情調，很深奧。「安住當下」，哇，聽起來很棒！當然囉！可是如果你不
了解空與顯，它就完全沒用！
為什麼要安住當下呢？而且，事實上根本沒有「當下」這個東西，它完全是假的。
首先，從究竟上來說，佛教徒不相信時間；「當下」是時間，所以它也不存在。其實我
會說，「夕陽禪定」還比較好，至少它給你一點憂傷的感覺，你可能還能曬一身黑亮的
皮膚。所以，禪定的訓練必須有一個好的、完整的道路。
要成為合格的創造福德的機器，禪定的訓練必須與第一個訓練───智慧的訓練─
──不相衝突。我之所以說這些，是因為我們往往被禪修的種種儀式轉移了注意力，以
為那比了解智慧重要。我們喜歡那些規矩，比如身體坐直，至少這是我們可以感知到。
這裡順帶一提一些佛教典型的禪修。
在眾多禪定的方法裡，有兩個是「止」和「觀」，相信你們已經聽說過上千萬遍，
所以我用幾句話作個概要的解釋。基本上，「止」是個詭計，而「觀」是生意。為了要
做生意，你需要這些詭計；因此「止」和「觀」都是必要的。
寂天大師剛出現在我腦海裡，所以我想我得提一下我想到了什麼。根據那些偉大的
大乘導師們，佛陀好比是個醫生，我們如同生病的人，我們有情緒煩惱的疾病。當你生
了一般的疾病時，比如頭痛，就只有你受苦；可是當你有情緒煩惱的疾病時，不只你受
苦，你同時讓別人也受苦。這其實是摘自寂天所說的話。
對於一般的疾病，我們有許多藥物可用。當我到藥房買藥，光是治療頭痛的藥就有
很多，治療情緒煩惱的藥卻極為稀少；事實上，只有佛陀才有。也許這話說得有點太過
分。許多靈性修道，比如印度教，也討論能去除這個情緒之病的藥方。許多修道提到像
是「愛你的鄰居」等方式，但只有佛陀提到去除情緒煩惱的因，也就是去除我執。這就
是為什麼它如此的稀有。只有佛的教法能對治這種病，禪定的訓練是佛所開的藥方。
我最近才了解到，從佛教的觀點嚴格來看，當今人們所謂的「禪定」，多數根本不
算是「三摩地」。大部分人以為，身體打直、緩慢呼吸、不要移動，這就是禪定；那不
一定是禪定，那只是身體坐直。
對於禪定，一個比較嚴謹的藏文用語是「釀札」。「釀」的意思是平等，「札」是
不打擾、不碰觸、順其自然。我對《道德經》十分推崇，它開頭短短幾句就說了許多關
於順其自然的道理。一切事物皆平等，沒有所謂的好、壞、對、錯、左、右，沒有這些
；一切事物皆平等，所以順其自然。不管你是坐直、倒立、躺下、在吊床上搖擺，或在
墨西哥度假勝地啜飲龍舌蘭酒，只要你可以做「釀札」───平等、順其自然，你就是
真正在修禪定。
三、戒律的訓練
最後是第三個戒律的訓練，這點很重要。如同三摩地的訓練，戒律的訓練也必須與
智慧有關。如果你的戒律與智慧無關，不論你做什麼───像繞行多次，用繩索將你的
身體完全綑綁起來───都不是我們這裡所談的戒律。
我們討論的是福德，所以我講的是積聚福德的方法，戒律和智慧不相衝突，這點很
重要。彌勒菩薩說，一個持戒的人心裡想：「噢，我的戒律持守得很好。我凌晨四點鐘
起床，不吃鴕鳥肉，我不殺蟑螂反而收養他們……」如果你以此為傲，你守的戒律與智
慧無關，這種戒律會使你變得像清教徒似的嚴肅而拘謹。
如果你變得嚴肅拘謹，你會有兩種「情結」。當你走在紐約蘇活區，你會有優越情
結，例如你看到妓女，你產生優越感，因而瞧不起她們。當你在路上看到耆那教的僧侶
，你會產生自卑情結。自卑感不是謙卑，它基本上像是憤怒，你會努力在耆那教僧侶的
身上挑毛病。
我們佛教徒常常做這種事，也許不該說我們，實際上是我常常做這種事。我覺得耆
那教那麼好，不知道為什麼它沒能在這世界上興盛起來。當我看見耆那教的出家人，我
立即的反應是：「他們沒有智慧，他們沒有空性和明覺。」而不是去欣賞他們瑣碎而狂
熱式的堅守非暴力原則。
狂熱式的非暴力，你們聽過這種說法嗎？舊金山有耆那教的中心嗎？你們應該上網
查查。聽說美國東岸有他們的中心，加州的這些比基尼可能對耆那教的僧侶來說多得難
以招架。
發誓受戒
我們再回來談「戒律」。任何事都可以當作是戒律。通常的建議是你自己規範自己
，而不是別人強迫你，不過你可以選擇去要求某個人給你戒律。你知道這稱為什麼嗎？
這就叫作「誓言」。
誓言可以是任何事。它可以是個很可悲的誓言，像新年願望之類的；也可以是吃完
很大一份義大利麵之後，立即產生的罪惡感：「從明天開始，我再也不吃義大利麵了。
」但是到了明天，你又吃了，然後你產生更多的罪惡感───一種「充滿罪惡感的誓言
」。
持有某種戒律來發展三摩地禪定，並進而發展智慧，這是必要的。假使這個戒律的
訓練還能利益他人，那更好，在大乘佛教裡尤其如此。
我要跟你們說，不要瞧不起微小的行為。也許我們沒有能力發一個像是「不殺鴕鳥
」的誓言，但你有力量發誓，刷牙時把水龍頭關上而不浪費水───你可以發這種誓言。
問題是，我們許多人認為這個誓言那麼微不足道。「我們不要發那種誓言，我們要
試著發些比較大的誓言，比如不要有性行為。」那樣的誓言就很難了！就算只是每個星
期三不要有性行為都很難，有時你會忘記。
不過老實告訴各位，我發現，連刷牙時關上水龍頭都並不容易。我們許多人會認為
這樣的小事和靈修的道路無關。關掉水龍頭？這有何靈性可言？其實這個戒律算不算是
靈修，完全在於你的動機，端看你多有創意。
如果你是菩薩，曾經受過菩薩戒，並且發過誓，每一次刷牙的時候都要關掉水龍頭
，這個行為就會利益眾生。這不只能幫助他們證悟，也有益於生態環境，還能幫助人類。
受戒或發誓是一個積聚福德資糧的好方式。比如說，現在，你我沒有到處殺人。我
們這樣沒有殺人已經過了多少年？我們沒去殺人其實只是因為我們沒有那個膽量，沒有
時間，沒有力氣，也沒有理由去殺人。
殺人要花很多時間，如果你殺人，就得花大量的時間在這件事情上───之前、之
後、和中間的過程。可是我們這樣有累積福德嗎？沒有。我們沒有累積殺人的惡業，也
沒有累積不殺人的善業；我們只是懶惰。
佛教積聚福德的方法非常巧妙，一個簡單的行為就可以積聚大量的福德。假設你一
開始就發誓不殺人，一旦發了誓，即使你在睡覺，因為你在睡覺時沒有殺任何人，所以
你分分秒秒都在累積福德。這是真的！所以如果你想要累積福德資糧，就得發誓。
其他積聚福德的方式
其他積聚福德的方式包括：做大禮拜，以粉碎傲慢；做供養，以對治慳吝；發露懺
悔不端的行為，以摧毀我執藏匿或築巢之處；隨喜他人善行，以對抗嫉妒；為了對抗錯
誤的知見，我們做兩件事───請上師轉法輪或開示，以及請上師住世；然後回向福德
。所以這應該回復了先前的問題：「積聚福德資糧是否太自私？」答案是否定的，自私
的「我」因為智慧已經消失了。
我要以兩段話作結論。佛法的道路有兩項挑戰，第一個是，有關實相的科學和哲學
在智識上非常難理解；第二個是，真正的相信───不是哲學討論的實相，而是實相本
身───是如此簡單，簡單到讓我們難以信任。
你們會有這兩項挑戰，第一個挑戰很容易，你可以閱讀書籍，問有關佛法的問題，
只要你能這樣做，你就會有進步。第二個挑戰很困難，這個挑戰在於「簡單」。你不能
閱讀書籍，沒有人能教你，你越問就越糊塗；解決之道在於「福德」。當你具足福德，
甚至聽到嬰兒的哭鬧聲，你會去想「噢，這就是了。」這整個世界也許會認為你是個白
痴，但誰在乎呢？所謂「什麼都不在乎」其實是對證悟一個相當好的描述。

n*s2011-04-20 07:04

3 楼

我有一个屏幕是用executive assistant的4x4 widget，然后每次转到那个屏幕，就能
看到数量不等的彩色横条在屏幕上，每次位置不一定一样
这个看着又不像屏幕的硬件问题，因为转到别的页的时候就没有。貌似这个也不是
assist的问题。最开始有google search widget的时候，也偶尔能看到这样的问题

n*w2011-04-20 07:04

4 楼

最近用GST beads，有个疑问，
bacteria pellet我没有用PBS dissolve，而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
N-lauroylsarcosine，25mM TEA和
1mM EDTA (pH 8.0)。
最近发现binding有些问题，因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
别就是target protein少了，这个我
没有观察到。
我在想到底是哪个地方出了问题。
有经验的同学指点一下～谢谢！

W*d2011-04-20 07:04

5 楼

Call and tell them your applications are not the same (personal vs. business
). That's how my friend got his approval.

【在 i****n 的大作中提到】

: Thank you for applying for a Business Card account. We
: are unable to approve your application at this time because
: of the following:
: o You have submitted multiple applications for credit.
: This is what I got from CITI. I already had two personal cards at the
: beginning of Nov and I was trying to apply this business card after 60
: days. Does anyone know how long I have to wait?

c*r2011-04-20 07:04

6 楼

我的有同样的毛病。而且还有 dust accumulating underneath the LCD screen.
need to get a replacement in Costco.

【在 n*****s 的大作中提到】

: 我有一个屏幕是用executive assistant的4x4 widget，然后每次转到那个屏幕，就能
: 看到数量不等的彩色横条在屏幕上，每次位置不一定一样
: 这个看着又不像屏幕的硬件问题，因为转到别的页的时候就没有。貌似这个也不是
: assist的问题。最开始有google search widget的时候，也偶尔能看到这样的问题

T*O2011-04-20 07:04

7 楼

Is your pH accurate? Is your pH meter calibrated properly?

i*n2011-04-20 07:04

8 楼

Thanks! Will do!

business

【在 W*****d 的大作中提到】

: Call and tell them your applications are not the same (personal vs. business
: ). That's how my friend got his approval.

l*a2011-04-20 07:04

9 楼

你试试看这样操作，我把屏幕显示彩条的widget删除了以后，重新加了个一样的widget
，然后彩条到现在都没有再出现。。。实在不明白为啥会这样，不过倒是看起来解决了
问题了
那个ldc下面dust的问题我估计怎么换机器都没用。。。htc那个后盖设计的方式就让
lcd周围很轻易暴露出来，你压一压边上，非常明显的能感觉到变形

【在 c*****r 的大作中提到】

: 我的有同样的毛病。而且还有 dust accumulating underneath the LCD screen.
: need to get a replacement in Costco.

n*w2011-04-20 07:04

10 楼

我这个solution没有测pH，这个也是我在想的一个问题，我要不要用PBS来配这个
buffer，然后将pH调到7.3。
我试一下明天。

%

【在 n***w 的大作中提到】

: 最近用GST beads，有个疑问，
: bacteria pellet我没有用PBS dissolve，而是用了自己配的一个solution, 内含1.5%
: N-lauroylsarcosine，25mM TEA和
: 1mM EDTA (pH 8.0)。
: 最近发现binding有些问题，因为ideally, binding前后的supernatant应该最明显的区
: 别就是target protein少了，这个我
: 没有观察到。
: 我在想到底是哪个地方出了问题。
: 有经验的同学指点一下～谢谢！

i*n2011-04-20 07:04

11 楼

business
I just called them and they told me that I have to wait for three months
after last application. I thought it was two months. Do you know it's two
or three months?

【在 W*****d 的大作中提到】

: Call and tell them your applications are not the same (personal vs. business
: ). That's how my friend got his approval.

d*e2011-04-20 07:04

12 楼

顺便问一下这个手机信号怎么样？看到有人抱怨这个问题。现在的手机室内信号不好
，整怕了，正想升级一个，

h*b2011-04-20 07:04

13 楼

为啥用lauroylsarcosine ? 这东西好像对珠子不好吧。ionic detergent,而且对你的
蛋白也不好啊。

%

【在 n***w 的大作中提到】

n*w2011-04-20 07:04

14 楼

Because most of my protein is in inclusion bodies and I don't wanna directly
go to the last resort dissolving
with guanidine hydrochloride, I found a protocol using this detergent to
increase the production of soluble
protein.
I know nothing about its physical chemical properties and I haven't thought
about the impact of this
ingredient.
Thanks.

【在 h*****b 的大作中提到】

: 为啥用lauroylsarcosine ? 这东西好像对珠子不好吧。ionic detergent,而且对你的
: 蛋白也不好啊。
:
: %

m*52011-04-20 07:04

15 楼

最明显的应该是beads上蛋白拿到一大堆
蛋白产量高的话轻易就能饱和beads,很难看出来的

C*e2011-04-20 07:04

16 楼

虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
但是好像pH 7.4是最佳binding
tech support的人也这么说
说buffer什么的不重要
重要的是pH
你的bead会不会饱和了？
然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
表达的还挺多
然后跟我的融合蛋白竞争
很容易就把柱子饱和了
哦，还有一个
你提到你的蛋白是inclusion body
我没用过N-lauroylsarcosine
如果好用的话回头汇报一下哈
不过我遇到inclusion body的时候用过Pierce的B-PerII
很好使
结果大部分都变成可溶了
当然我的那个例子比较极端
光用sonication是大多数都在pellet里
用B-PerII加sonication以后大多都在上清里
我一升的e.coli居然提了快100 ug的蛋白

%

【在 n***w 的大作中提到】

b*n2011-04-20 07:04

17 楼

100 ug/L的产量好像少了点，是不是蛋白有毒性或者太大？

【在 C*******e 的大作中提到】

: 虽然我们也用pH 8的条件做GST蛋白纯化
: 但是好像pH 7.4是最佳binding
: tech support的人也这么说
: 说buffer什么的不重要
: 重要的是pH
: 你的bead会不会饱和了？
: 然后我还遇到过的是除了融合蛋白以外还有27 kDa的GST-tag only表达
: 表达的还挺多
: 然后跟我的融合蛋白竞争
: 很容易就把柱子饱和了

n*w2011-04-20 07:04

18 楼

嗯，有可能饱和了。
我昨天把1st binding后的supernatant又加beads了，看好没好些今天。
我觉得N-lau还是挺好使的。能solubilize大部分pellet。
我500ml的culture提了差不多160ug的蛋白。。。
我下次买点你说的B-Per试试好了～（不过看成分也差不多）
我现在的protocol基本上是：(For 500ml culture)
1. thaw pellet on ice
2. add 18ml GST buffer (配方见上)，add 1% PI, add 2ml lysozyme (10mg/ml)，
mix on ice for 30 seconds
3. pass thru 20G syringe to reduce viscosity, also add DNAse 40ul (1mg/ml).
4. sonication (it will become clear)
5. 10000rpm, 40min，4deg
6. collect supernatant for GST beads binding
不过我这次还是将GST buffer的pH调到了7.4左右。不调的话差不多是9左右。

【在 C*******e 的大作中提到】

C*e2011-04-20 07:04

19 楼

昨天晚上稀里糊涂吧单位打错了
是一升提了100 mg

【在 b******n 的大作中提到】

: 100 ug/L的产量好像少了点，是不是蛋白有毒性或者太大？

C*e2011-04-20 07:04

20 楼

记下了
谢谢！
下次要试试看。

(1mg/ml).

【在 n***w 的大作中提到】

: 嗯，有可能饱和了。
: 我昨天把1st binding后的supernatant又加beads了，看好没好些今天。
: 我觉得N-lau还是挺好使的。能solubilize大部分pellet。
: 我500ml的culture提了差不多160ug的蛋白。。。
: 我下次买点你说的B-Per试试好了～（不过看成分也差不多）
: 我现在的protocol基本上是：(For 500ml culture)
: 1. thaw pellet on ice
: 2. add 18ml GST buffer (配方见上)，add 1% PI, add 2ml lysozyme (10mg/ml)，
: mix on ice for 30 seconds
: 3. pass thru 20G syringe to reduce viscosity, also add DNAse 40ul (1mg/ml).

n*w2011-04-20 07:04

21 楼

哇。。。
还有就是我这次的GST buffer是用PBS配的，不是用水，也许有些salt的成分比较好把～
谢谢包子～

【在 C*******e 的大作中提到】

: 昨天晚上稀里糊涂吧单位打错了
: 是一升提了100 mg