求助反转录PCR - 未名空间MITBBS历史存档

国际科技财经博客移民网络热点娱乐民生时事公众号

Redian新闻

>未名空间

>Biology - 生物学

求助反转录PCR

求助反转录PCR# Biology - 生物学

I*S2011-05-16 07:05

1 楼

母亲单身退休，第一次签没过。我一直安慰鼓励她，深怕她被所谓的“硬伤”吓怕了，
还告诉她版上多少通过的例子，人家能过她也能。只要自己好好准备，有自信，即使最
后还是签不过也没关系。
母亲一向朴实，这次却专门买了毛领大衣，昨天下午还去把头发盘了。我跟她视频的时
候一个劲儿称赞她好看，逗得老人家嘴都合不拢，估计也对她心态有了些正面影响。上
次签感觉她特紧张，老担心被问到单身退休的情况。这次我跟她说，没啥怕的，多提提
跟外婆一起生活，家人朋友多，往来频繁，小日子过得滋润充实的事儿。尽管最后也没
机会说到这些，但是她这次去签证明显状态比上次好，一直笑呵呵的，可能也感染到了
签证官吧。
母亲一上前，就把订成一摞儿的我给签证官的信，给她做的行程安排，机票查询情况，
还有给她的邀请信递给签证官。
签证官随便翻了翻，就问：你女儿在美国哪个州？
母亲说：**州读博士。
签证官：你有她的签证复印件吗？
母亲就把我的一摞儿复印件递给他看。
签证官：你去美国待多久？
母亲：两个多月，3月**号去，6月**号回。
签证官开始输入，给红条。
母亲笑着说谢谢，签证官点了点头。
母亲总体感觉这次签证通过率比上次高很多，遇到的签证官态度也和蔼很多。所以成都
的朋友们，好好准备吧。多来版上借鉴一下大牛们提供的签经和资料。我个人最大的体
会还是，自我信心很重要，但自我信心的构建还是来自于稳扎稳打的准备。
再次感谢大家的热心分享。祝愿正在准备的朋友们都顺利拿到签证！

S*U2011-05-16 07:05

2 楼

鉴于本版也有基督徒来，略述如下∶
1. 爱人如己。佛法有慈心无量。
2. 摩西十诫中的不杀、不盗、不邪淫，是佛法五戒中的三项。
3. 重视信仰使心安，产生力量。佛法的三十七菩提分中，有信根、信力。三十七菩提
分还以慧根、慧力，平衡信力，增长信力。
4. 相信有来生。佛法说不只有来生，还有过去生。
5. 相信正义，善有善报，恶有恶报。佛法说业报是自然法则。
欢迎补充。
对基督教教义的批评，基版很多，本帖不提。本帖只谈教义，谈基督徒的表现如何就离
题了。
这些优点，没有信仰的人也可能有 1, 2。不过 3 也许有困难。信唯物，人死如灯灭，
如何心安面对死亡？对于 5，相信天道、自然神，人本主义，也可以相信有正义。
我说的「佛法」，指原始佛教经典，学术界公认为佛陀所说。

n*82011-05-16 07:05

3 楼

想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA，可是怎么pcr都不work.
但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段（～1kb）都能被P出来。现在怀疑是不
是反转没有得
到全长的cDNA。
请教大侠，一般这种情况该怎么对付？
不甚感激！

g*t2011-05-16 07:05

4 楼

此等比较意义不大，其他宗教或派别比较起来也大抵如此。
若要做比较，法轮功之流还比基督教更接近佛教。
然而他们毕竟都不符合佛法的三法印，与佛法有根本的区别。
你的结尾部分还是不忘贩卖私货啊。

【在 S**U 的大作中提到】

: 鉴于本版也有基督徒来，略述如下∶
: 1. 爱人如己。佛法有慈心无量。
: 2. 摩西十诫中的不杀、不盗、不邪淫，是佛法五戒中的三项。
: 3. 重视信仰使心安，产生力量。佛法的三十七菩提分中，有信根、信力。三十七菩提
: 分还以慧根、慧力，平衡信力，增长信力。
: 4. 相信有来生。佛法说不只有来生，还有过去生。
: 5. 相信正义，善有善报，恶有恶报。佛法说业报是自然法则。
: 欢迎补充。
: 对基督教教义的批评，基版很多，本帖不提。本帖只谈教义，谈基督徒的表现如何就离
: 题了。

C*e2011-05-16 07:05

5 楼

1.可能没有全长cDNA
2.可能有全长cDNA，但是用的DNA polymerase没办法从你的模板里p 9kb
解决方法可以有
1.如果对cDNA质量有怀疑，重新制备
2.换DNA polymerase，我用过TAKARA的LA DNA polymerase，不过模板不是cDNA，是细
菌gDNA，
扩了13kb。模板是细菌gDNA还是人/老鼠 gDNA还是cDNA还有区别的，可以参考他们网站
3.既然小段的可以P出来，就重新设计引物，分两段或者分三段甚至四段扩，（互相
overlap)分别扩
好了以后再做mega PCR

【在 n**8 的大作中提到】

: 想从cDNA文库PCR拉出一条9kb的DNA，可是怎么pcr都不work.
: 但是这条长的cDNA当中的相互overlap的小片段（～1kb）都能被P出来。现在怀疑是不
: 是反转没有得
: 到全长的cDNA。
: 请教大侠，一般这种情况该怎么对付？
: 不甚感激！

G*s2011-05-16 07:05

6 楼

佛陀是谁啊

c*r2011-05-16 07:05

7 楼

9kb不算太过分，上面葡萄mm做了13kb，但是9kb确实也比较长，rt可能需要调整一下
protocol。实在不行只能分段pcr，然后接起来

【在 n**8 的大作中提到】

g*t2011-05-16 07:05

8 楼

没想到火星上也有基督教啊。

【在 G*******s 的大作中提到】

: 佛陀是谁啊

s*y2011-05-16 07:05

9 楼

这个不太可能是反转录的问题，更可能的是你克隆PCR的问题，
因为９k有点长的，一般的酶没有那么processive

【在 n**8 的大作中提到】

G*s2011-05-16 07:05

10 楼

上帝的爱长阔高深
哈哈哈

【在 g***t 的大作中提到】

: 没想到火星上也有基督教啊。

n*82011-05-16 07:05

11 楼

多谢大家的回复
PCR条件还好，因为同样的引物从genomic DNA 中能P出更长的（11kb），这是我的
positive control。
我是怀疑我的RT有问题。

S*U2011-05-16 07:05

12 楼

断灭唯物论与有信仰的就不同。
外道都不符合佛法的三法印，这点同意。会不会用三法印来判断自己知见是否符合佛法，要有慧根。慧根从亲近善知识，听闻正法，如理思惟而增长。这才能避免以非法为法、法为非法的过失。
阿含经等原始佛教经典，学术界公认为佛陀所说。其实南北传都公认。你知道哪位佛教大德否认阿含是佛说吗？

【在 g***t 的大作中提到】

: 此等比较意义不大，其他宗教或派别比较起来也大抵如此。
: 若要做比较，法轮功之流还比基督教更接近佛教。
: 然而他们毕竟都不符合佛法的三法印，与佛法有根本的区别。
: 你的结尾部分还是不忘贩卖私货啊。

n*82011-05-16 07:05

13 楼

我是想1.）证明这个长片段cDNA的存在，现在这个9kb是annotated （估计要做northern)
2.）克隆这个长片段并测序

E*l2011-05-16 07:05

14 楼

基版此刻正在"爱人如己"呢, 去看看吧. LOL

【在 S**U 的大作中提到】

s*y2011-05-16 07:05

15 楼

如果RT-PCR (oligo-dT做的话) 出了问题的话，那么你用靠近3'-end 和靠近
5'-end 的primer pairs 来作出的PCR 的条带粗细会有比较大的差别。
当然，也可以直接用northen 来证明。

【在 n**8 的大作中提到】

: 多谢大家的回复
: PCR条件还好，因为同样的引物从genomic DNA 中能P出更长的（11kb），这是我的
: positive control。
: 我是怀疑我的RT有问题。

g*t2011-05-16 07:05

16 楼

你显然误会我说的了。阿含是佛教的经典，这个毫无疑问。我说的是有的人拿南传/阿
含当武器，打着南传/阿含的旗，贩卖否定大乘的货。

法，要有慧根。慧根从亲近善知识，听闻正法，如理思惟而增长。这才能避免以非法为
法、法为非法的过失。
教大德否认阿含是佛说吗？

【在 S**U 的大作中提到】

: 断灭唯物论与有信仰的就不同。
: 外道都不符合佛法的三法印，这点同意。会不会用三法印来判断自己知见是否符合佛法，要有慧根。慧根从亲近善知识，听闻正法，如理思惟而增长。这才能避免以非法为法、法为非法的过失。
: 阿含经等原始佛教经典，学术界公认为佛陀所说。其实南北传都公认。你知道哪位佛教大德否认阿含是佛说吗？

C*e2011-05-16 07:05

17 楼

如果说你需要的只是把这段cDNA扩出来
好作为实验材料进行下面的步骤
就不要去走弯路，证明长片段存在什么的
很多时候生物实验做啊做啊会容易舍本逐末
不过我不了解你的实验哈
就是这么一说

northern)

【在 n**8 的大作中提到】

: 我是想1.）证明这个长片段cDNA的存在，现在这个9kb是annotated （估计要做northern)
: 2.）克隆这个长片段并测序

G*s2011-05-16 07:05

18 楼

阿含是小乘的么？

【在 g***t 的大作中提到】

: 你显然误会我说的了。阿含是佛教的经典，这个毫无疑问。我说的是有的人拿南传/阿
: 含当武器，打着南传/阿含的旗，贩卖否定大乘的货。
:
: 法，要有慧根。慧根从亲近善知识，听闻正法，如理思惟而增长。这才能避免以非法为
: 法、法为非法的过失。
: 教大德否认阿含是佛说吗？

C*e2011-05-16 07:05

19 楼

hoho，承蒙院长还记得偶～

【在 c******r 的大作中提到】

: 9kb不算太过分，上面葡萄mm做了13kb，但是9kb确实也比较长，rt可能需要调整一下
: protocol。实在不行只能分段pcr，然后接起来

S*U2011-05-16 07:05

20 楼

南传本来就不承认大乘经。大乘非佛说的主张, 自古就有。
我批评的是神我见。佛陀反对神我见，你总知道吧。你能引经说明白什么是神我见嘛？

【在 g***t 的大作中提到】

n*w2011-05-16 07:05

21 楼

原来你是mm。。。

【在 C*******e 的大作中提到】

: hoho，承蒙院长还记得偶～

S*U2011-05-16 07:05

22 楼

阿含经是原始佛教，佛教经典第一次结集出来的。
学术界现在很少用「小乘」一词。It shows you are unprofessional, if not
ignorant.

【在 G*******s 的大作中提到】

: 阿含是小乘的么？

n*82011-05-16 07:05

23 楼

谢谢大家的建议，因为还没有这个长片段的cDNA的证据，所以想先证实是存在的。。。
（香槟葡萄的ID好像很眼熟。。。）

G*s2011-05-16 07:05

24 楼

我只是了解一下常识，还学术界，只要脱离了民间迷信就好了
目前没有太高的奢求
按照你的说法观音菩萨让唐僧去取经取的岂不是伪经了？

【在 S**U 的大作中提到】

: 阿含经是原始佛教，佛教经典第一次结集出来的。
: 学术界现在很少用「小乘」一词。It shows you are unprofessional, if not
: ignorant.

C*e2011-05-16 07:05

25 楼

这个还“原来”
我真是要吐血

【在 n***w 的大作中提到】

: 原来你是mm。。。

J*s2011-05-16 07:05

26 楼

晕！

【在 G*******s 的大作中提到】

: 我只是了解一下常识，还学术界，只要脱离了民间迷信就好了
: 目前没有太高的奢求
: 按照你的说法观音菩萨让唐僧去取经取的岂不是伪经了？

c*r2011-05-16 07:05

27 楼

是，这完全看lz想干嘛。
如果想clone这个cDNA来表达：那么就是一段一段clone了拼起来好了。
如果想看这个mRNA的表达量：可以northern，或者qPCR，不用管全长啥的。
如果想证明是否全长表达：可以做两个probe，一个在5'，一个在3'，做northern
完全没有必要一次RT全长RNA。
嘻嘻，没想到咱们同行，hand hand，以后mm多多指教

【在 C*******e 的大作中提到】

: 如果说你需要的只是把这段cDNA扩出来
: 好作为实验材料进行下面的步骤
: 就不要去走弯路，证明长片段存在什么的
: 很多时候生物实验做啊做啊会容易舍本逐末
: 不过我不了解你的实验哈
: 就是这么一说
:
: northern)

S*U2011-05-16 07:05

28 楼

唐玄奘取回来的经，也包括说一切有部对阿含经的解释，如两百卷的大毗婆沙论等。唐玄奘西行求法，最主要的是要学瑜伽师地论。占瑜伽师地论约1/3的声闻地，是对阿含经的解释，而摄事分与摄异门分，是对阿含经的逐经解释与名相整理。所以还是很有收获的。这些是现在南北传原始佛教研究的重要材料。
早期结集佛经，判定是否伪经，是以是否符合最早结集的阿含经作标准。大乘经中虽有伪经（藏经立疑伪部），符合阿含经的也不少。而在中国流行的楞严经，在印度无人听过，虽然内容荒谬处不少，被论证是伪经，汉传还是有人坚信不移是佛说。

【在 G*******s 的大作中提到】

: 我只是了解一下常识，还学术界，只要脱离了民间迷信就好了
: 目前没有太高的奢求
: 按照你的说法观音菩萨让唐僧去取经取的岂不是伪经了？

n*82011-05-16 07:05

29 楼

我想要先测序再克隆。

c*r2011-05-16 07:05

30 楼

what？？？
反了吧？测序可以跟DNA上直接测，不用RT那么麻烦。如果一定要测RNA，那可以一段一
段测啊，反正也不能一次读9kb。设计几对sequence sepecific的primers去RT-PCR好了
。设计primer的时候可以在头尾加上内切酶位点，PCR product一半去测序，一半切一
下去克隆。

【在 n**8 的大作中提到】

: 我想要先测序再克隆。

C*e2011-05-16 07:05

31 楼

hand一下
我不去宝宝版了
所以比较少见到你啦

【在 c******r 的大作中提到】

: 是，这完全看lz想干嘛。
: 如果想clone这个cDNA来表达：那么就是一段一段clone了拼起来好了。
: 如果想看这个mRNA的表达量：可以northern，或者qPCR，不用管全长啥的。
: 如果想证明是否全长表达：可以做两个probe，一个在5'，一个在3'，做northern
: 完全没有必要一次RT全长RNA。
: 嘻嘻，没想到咱们同行，hand hand，以后mm多多指教

n*82011-05-16 07:05

32 楼

sorry. 讲得有点confusing了。
其实是想请教大家对于反转长片段cDNA的一些技术窍门儿。。。

i*l2011-05-16 07:05

33 楼

你还真是较真儿
问你，光克隆个长的，能发文章不？
买房子讲究Location,搞生物讲究Phenotype，
有了表性才能发文章搞Grant，细枝末节较真儿没有多大意思
你克隆做的再好，有如何？
现在估计花钱都能让公司做克隆了

【在 n**8 的大作中提到】

: sorry. 讲得有点confusing了。
: 其实是想请教大家对于反转长片段cDNA的一些技术窍门儿。。。

n*82011-05-16 07:05

34 楼

发不发文章跟克隆长短没有关系，现在早就不是克隆基因的年代了。
可是这个真的跟我做的biological story有关系啊。
呵呵，不较真了。

I*r2011-05-16 07:05

35 楼

在反转录时，不适用random primer，直接使用你的primer，是否可行？

【在 n**8 的大作中提到】

c*r2011-05-16 07:05

36 楼

你说说你的story？很多实验技术上有时候会有这样那样的难题。虽然不是不可解决，
但是如果答案比手段更重要的时候，太纠结于一个手段没有必要。想个办法绕过去好了
。关键是这样节省很多时间，咱们自己的青春不是。
如果你一定要RT一段很长的RNA，9kb并非不可能，但是效率比较低，也不是非常
reliable。更重要的是里面可能会有错误。如果你觉得这都不重要，就是把它RT出来最
重要，建议你找找有没有想关的protocols，应该有很多很多。
比如invitrogen的这个kit，就可以rt up to 9kb：
https://commerce.invitrogen.com/index.cfm?fuseaction=iProtocol.
unitSectionTree&treeNodeId=3DE1D285EC91ED2AA3E282E1D0D52A68
还有qiagen的这个kit，up to12.5kb：
http://www.qiagen.com/products/pcr/longrange/qiagenlongrangepcr

【在 n**8 的大作中提到】

: 发不发文章跟克隆长短没有关系，现在早就不是克隆基因的年代了。
: 可是这个真的跟我做的biological story有关系啊。
: 呵呵，不较真了。

Z*52011-05-16 07:05

37 楼

制备cDNA方面可以做的改进：
1，最好直接用gene specfic primer做反转录，延长反转录反应的时间；
2，如果不用1，最好用oligo dT；
3，如果非要用随机引物，最好减少引物用量（参考invitrogen SuperScript Ⅲ说明书）

n*82011-05-16 07:05

38 楼

多谢回复！
to院长，
想弄下来测序，看看怎么splicing的，还有看看predicted的motif还在不在，你之前说
的那个分段测序，我已经做过了，可是这并不能说明这个全长的cDNA存在啊？准备做
northern，但是也只能看size，具体的molecular lesion 还是不确定。
你说的这么长PCR出来不reliable，只是先粗测序看看，真正要最终高保真的克隆，当
然会分段做。
to Zifeng9527，
想搞全长的cDNA，自然尽量不会去用random primer 反转。