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求教基因组PCR

求教基因组PCR# Biology - 生物学

j*l2011-05-23 07:05

1 楼

这个老印坐我旁边，但从不搭理我，喜欢跑大老板二老板办公室套近乎。老板最近刚给
他加了薪发了奖金安排最好的座位，老印刚从印度度假一个月回来，丫第二天就辞职了
。老板好言相劝希望他留下，最后还给他开了送别party.老印最后还是走了。
今天一个同事发现老印在程序里留下几句脏话，就是boos fucked之类的。这些脏话会
出现在程序界面的几个地方，会被用户看到。不知老板看到了会有何想法。。。。

V*62011-05-23 07:05

2 楼

修真三万年是这几年最好的仙侠类作品，这本书的情节很精彩，我之前应该分析过，这
次不说情节了。目前这本书写了三千多章了。我还有一百多章存货没看完。
修真三万年把修仙写的十分残忍，同时是把修真和修仙当做不同的修炼体系来区分后，
让两者变成死敌，互相觉得对方是邪门歪道。都要把对方干死。之所以这样，是因为一
个人修炼到越高级别，对资源的要求越多，而宇宙的总体资源师有限的，所以就需要干
掉和自己争夺资源的人，这些人天生自私，所以叫做修仙，仙人没感情。
另外一种觉得修真是让我们能力很大，但是我们本质还是人，需要有平等思维。所以互
相把对方当死敌。
开始只是觉得这设定很精彩很残酷，后来看三体后，才觉得这其实本质就是黑暗森林法
则，而这种法则，搞不好真是宇宙的真相。

a*o2011-05-23 07:05

3 楼

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p*u2011-05-23 07:05

4 楼

一个硬盘，一个dvd drive
这杨配置，电源功率用多少的？
500W 够不？
谢谢

a*f2011-05-23 07:05

5 楼

要扩增的基因组片段2kb，GC含量44%左右，看起来不是难P的那种。我用的是
invitrogen的Pfx高保真酶，设计了6对引物，结果都没P出来。后来尝试过提高镁离子
浓度，降低退火温度，结果还是P不出来T T
恳请达人指点该怎么办，多谢了bow

t*u2011-05-23 07:05

6 楼

要是跟你没关系
就当作没看见，等觉得用户看见的时候，在给老板说。。。。

s*92011-05-23 07:05

7 楼

名字就可以看出是战锤40k 的框架，转个评论：
https://noxiv.com/sc/book/5517a0d6179d91e8774040e5
对于本书，相信很多书友都或多或少的听说过。这本书在一部分读者心中被奉为神作，
而在一些人口中却是一本毒草，导致这种两极化的原因就在于前期的小白文写作风格。
（通过故事场景的变换，我们可以将它分为“天元篇” “飞星篇” “血妖篇” “古
圣篇” “回归篇” 以及“帝国篇”）在这里，所谓的前期小白文风格指的是第一篇天
元篇的故事及行文。
首先让我们来看设定。在谈论设定之前，必须清楚一点，这实际上是一本套着修真外壳
的软科幻文。本书的设定基于战锤40k（如书中的英雄帝皇，以及帝皇分身的叛变。）
，且套用了部分三体的黑暗森林原理，营造出一个弱肉强食的宇宙基调。对于大背景的
设定，作者选择了跟吞噬星空同样的方法：通过事件自然引出。然而，与吞噬星空不同
之处在于，在天元篇所揭露的“设定”，并不是本书的完整设定，随着剧情的一步一步
发展，主角通过触发各种剧情，不断地修改、补完甚至推翻设定，给读者一种参与感，
可以让读者通过推理来猜测整个世界的真正面貌。
书中的主线矛盾从一开始的人妖对立（种族矛盾）→修真修仙对立（意识形态对立）→
三国争霸（国家利益角逐），在这期间还带有异族（天魔）威胁和历史遗留问题（盘古
文明）。整个世界背景不断扩大，出场角色、种族、政治制度不断增多，如何处理这些
错综复杂的关系是对作者的一个很大挑战。
就目前的形式表明，作者的设定细节基本没有逻辑问题，在整个设定中，人类文明基本
上是靠发掘之前的遗留文明来发展的，整个文明体系是处于倒退状态，这为盘古族和圣
盟的出现提供了基础。而帝皇的陨落和血神子叛乱则为星海中央帝国的崛起提供了舞台
。星海共和国转变为真人类帝国的原因和方法，与星球大战中银河共和国的毁灭有异曲
同工之妙（人为利用国内外压力压垮代议制政府，建立威权体制）。而联邦通过长期与
势均力敌的对手妖族的斗争，体会到了团结的重要性，再加上历史保存的相对滞后性与
短暂性，成功发展出了民主制，且处于民主制发展的上升阶段，建立了人人平等的修真
制度，也为之后的人妖合流奠定了基调。可以说现在出场的每一个势力，其出场原因和
发展模式都经得起推敲。
而对于书中修真（科幻）技术的描写，受限于自身原因，作者在这方面没有出彩之处，
无法与一些硬科幻作品相提并论，这是这本书的缺陷之一。
接下来说一下情节。整本书的主角看起来是李耀，尤其通过第一卷的描写，营造出一种
都市装逼打脸流的错觉，这也是很多新读者无法接受的一点。但随着剧情的发展，李耀
逐渐成为了一条故事的线索，与其说是李耀去塑造故事，更不如说是李耀带着读者去经
历故事。在飞星卷中，出现了重要角色白老大。李耀与白老大在地底进行的恐怖平衡，
以及发现的黑暗森林体系，标志着这一部书开始走向正轨，去主角化逐渐加强。在血妖
界与金屠异的交手，赤潮计划的出现，后来与吕醉的交锋，表示着这本书逐渐脱离了正
邪二元论（主角团永远伟光正，反派团永远假恶丑）。一直到帝国篇李耀与皇后的联手
，立场的正邪已经不再重要，国家的利益成为了博弈的关键。
整个故事的矛盾在不断由简单化走向复杂化，每个人的立场都有可能改变，再加上作者
不断地加入现实世界的投影，使得整个世界的剧情走向混沌化。从天元篇的人妖大战，
到飞星篇帝国浮出水面，到血妖篇妖族历史的揭露（人妖同源很多人都没想到），到回
归篇古圣界的政治投机，再到帝国篇李耀的驱虎吞狼，剧情转折不说出人意料，但也算
得上跌宕起伏。一直到现在，读者们都不敢扬言可以确定结局走向，毕竟从一开始就埋
下的“地球灭亡”伏笔，随时可以将设定从战锤系列转变成ME系列。
再说人物塑造。作者笔力不行这是他的短板，他无法想烽火那样通过描写来塑造人物形
象，这就使得作者只能通过事件来侧面塑造人物形象。到目前为止，作者塑造的形象中
，最鲜明的只有三人：金屠异，白星剑和赫连烈。对于第一人，很多书友都没有异议，
金屠异的强在于它的智力，从以战促和，赤潮计划和阻击黑风，作者成功塑造了一个多
智近妖的角色。而白星剑的成功在于对他指挥能力，狂放性格和在黑风之战时对儿子的
保护体现出来。
而赫连烈，很多新读者可能不陌生，第一卷里主角最开始的敌人，是一个“小白文标准
仇敌”，在被主角整垮了家族之后再没出场，一直到一千多章之后以疯狗的名义再出，
并以生命为代价为联邦争取了关键的两小时。通过战后李耀与赫连烈女儿的交谈，我们
看到了一个被年青时的嚣张和主角光环所毁掉人生的可怜人。个人认为赫连烈的描写是
作者人物塑造中最立体的一个，虽然篇幅不多，但冲击力十足，在我看过的小说从没有
一个作者将视线投向过失败者和他们的家庭，以及他们所面临的困境。老牛是第一个。
可以说就这一个情节足以让本文成为第一流的佳作。黑风之战时老牛人物塑造的集体爆
发期，但受限于笔力，老牛无法长期维持这种状态。
但是，天元卷的小白行文为整本书留下了很深的伤害。像陆音希，司佳雪等“典型小白
文女主”再没有出现过，同样神隐的还有天元篇里大部分人物。奇妙的是当你回头再看
这一篇章，会有一种对人生际遇的感慨。当然，这不是作者的主观布局意图，所以天元
卷还是本书的败笔。
接下来说一下老牛的软肋，也可以说是很多作者的软肋——文笔。我始终认为老牛的文
笔不足以支撑这本书的架构。这本书在同时期的软科幻网络小说中毫无疑问是属于第一
流的水准，但是凭老牛所架构的这个世界，它本来可以更好。老牛的笔力限制了他难以
掌控大场面，这也是整个网络小说的发展趋势：从紫川，佣兵天下的战争刻画逐渐走向
个人英雄战斗刻画。而老牛这个弱点在本书中显得尤为致命。帝国篇之前还勉强可以支
撑，可以用布局＋阴谋＋战术的形式来推动势力发展，可是当主角进入帝国开始，之前
的斩首战术和阴谋论已经难以对帝国和圣盟形成关键影响。它们可以作为重要的一部分
，但是无法成为主线。用阴谋来推动剧情当然可以，但是这很可能会造成逻辑漏洞，影
响本书质量。联邦、帝国、圣盟，完美的三国关系，最是适合群像描写的舞台，通过战
争、阴谋、政治等等手段来进行国力竞争。如果这一部分能写出理想效果，那么鲜明的
人物，经典的场面设计，出色的计谋设置，这些都能够表现得出来。凭借这一段剧情，
本书足以成为最经典的网络小说之一。很可惜，凭借作者现在的笔力，这一点可能难以
达到，操作不好甚至有可能结局崩盘。我个人的建议是要么作者将40k的世界分为几本
小说来共同构建，要么学习临高采用集体创作形式。如此大气且逻辑严密的设定与构思
在现在的网络小说中非常罕见，如若写崩真是十分可惜。
总体来看，40k的设定是其最出彩的地方，如果设定是骨，那么作者自己对于社科的理
解就为这本书增加了完美的肌肉。而作者笔力的不足却也限制了本书的发展。书中还有
很多支线我没有一一细说，老读者就不要来挑刺了。对于笔力有所追求的读者，40k的
吸引力可能不是那么大，我对它的五星好评主要是基于其潜藏的极高上限，以及40k世
界可以挖掘的丰富内容。

【在 V********6 的大作中提到】

: 修真三万年是这几年最好的仙侠类作品，这本书的情节很精彩，我之前应该分析过，这
: 次不说情节了。目前这本书写了三千多章了。我还有一百多章存货没看完。
: 修真三万年把修仙写的十分残忍，同时是把修真和修仙当做不同的修炼体系来区分后，
: 让两者变成死敌，互相觉得对方是邪门歪道。都要把对方干死。之所以这样，是因为一
: 个人修炼到越高级别，对资源的要求越多，而宇宙的总体资源师有限的，所以就需要干
: 掉和自己争夺资源的人，这些人天生自私，所以叫做修仙，仙人没感情。
: 另外一种觉得修真是让我们能力很大，但是我们本质还是人，需要有平等思维。所以互
: 相把对方当死敌。
: 开始只是觉得这设定很精彩很残酷，后来看三体后，才觉得这其实本质就是黑暗森林法
: 则，而这种法则，搞不好真是宇宙的真相。

t*g2011-05-23 07:05

8 楼

看你啥显卡，普通的一般这一套不OC满载不会超过300W.

【在 p****u 的大作中提到】

: 一个硬盘，一个dvd drive
: 这杨配置，电源功率用多少的？
: 500W 够不？
: 谢谢

l*g2011-05-23 07:05

9 楼

看看局部的GC含量?PCR KIT好不好用?
加DMSO,延长extension时间

【在 a*****f 的大作中提到】

: 要扩增的基因组片段2kb，GC含量44%左右，看起来不是难P的那种。我用的是
: invitrogen的Pfx高保真酶，设计了6对引物，结果都没P出来。后来尝试过提高镁离子
: 浓度，降低退火温度，结果还是P不出来T T
: 恳请达人指点该怎么办，多谢了bow

j*l2011-05-23 07:05

10 楼

同事已经发给team所有人了，包括老板。。。。

【在 t*********u 的大作中提到】

: 要是跟你没关系
: 就当作没看见，等觉得用户看见的时候，在给老板说。。。。

n*52011-05-23 07:05

11 楼

小错。
《修真四万年》

p*u2011-05-23 07:05

12 楼

谢谢老大
X58 的板子，是不是随便抓一个那个便宜就买哪一个就行了？
不太想等 sb 了

【在 t****g 的大作中提到】

: 看你啥显卡，普通的一般这一套不OC满载不会超过300W.

a*f2011-05-23 07:05

13 楼

谢谢，能不能推荐其它PCR kit？多谢了

【在 l******g 的大作中提到】

: 看看局部的GC含量?PCR KIT好不好用?
: 加DMSO,延长extension时间

j*l2011-05-23 07:05

14 楼

我在想他可能还不知道，找老板要reference的时候估计老板很生气。。。

【在 t*********u 的大作中提到】

: 要是跟你没关系
: 就当作没看见，等觉得用户看见的时候，在给老板说。。。。

M*t2011-05-23 07:05

15 楼

最近这一卷太水了，都是废话，主人公有十几二十章不出现的。适合在家忙家务的时候
听。漏掉个半个一个小时都可以无缝衔接

t*g2011-05-23 07:05

16 楼

基本上不会太差。

【在 p****u 的大作中提到】

: 谢谢老大
: X58 的板子，是不是随便抓一个那个便宜就买哪一个就行了？
: 不太想等 sb 了

a*f2011-05-23 07:05

17 楼

谢谢，能不能推荐其它PCR kit？多谢了

【在 l******g 的大作中提到】

: 看看局部的GC含量?PCR KIT好不好用?
: 加DMSO,延长extension时间

r*t2011-05-23 07:05

18 楼

这书到底啥水平？和凡人比呢？

t*y2011-05-23 07:05

19 楼

ud3r or sabertooth
don't try cheap ones.

【在 p****u 的大作中提到】

: 谢谢老大
: X58 的板子，是不是随便抓一个那个便宜就买哪一个就行了？
: 不太想等 sb 了

c*r2011-05-23 07:05

20 楼

引物和PCR条件是啥？
基本参数要告诉大家吧

【在 a*****f 的大作中提到】

m*n2011-05-23 07:05

21 楼

凡人是从个人的较毒看问题，这个是占在人类的较毒看问题。看你好哪一口了。
如果嫌这个还不够GDS的话，那么去看三*～体吧，女主是葱所有智慧剩物的较毒看问题
的。
如果这还不螚满足你，那么我还可以推剪佛经。那个是从所有生物的较毒。

p*u2011-05-23 07:05

22 楼

这两个差不多好，是吗？？

【在 t*******y 的大作中提到】

: ud3r or sabertooth
: don't try cheap ones.

r*e2011-05-23 07:05

23 楼

要不试试takara的Extaq或者LAtaq？
pfx效率是比较低。

【在 a*****f 的大作中提到】

: 谢谢，能不能推荐其它PCR kit？多谢了

n*52011-05-23 07:05

24 楼

挺好。
象个大西红柿，水分虽然多，但味道还行。

【在 r******t 的大作中提到】

: 这书到底啥水平？和凡人比呢？

w*n2011-05-23 07:05

25 楼

推荐invitrogen Taq PCRx DNA Polymerase，一个半年没批出来的基因，用这个搞定了。

【在 a*****f 的大作中提到】

b*12011-05-23 07:05

26 楼

谢推荐。目前看到第4卷。前3卷都非常精彩，颇有黄易星际浪子的风采，个人觉得和凡
人第一卷同一量级。
可惜第4卷开始变得太拖拉了。。。

a*f2011-05-23 07:05

27 楼

引物设计了两种，一种21bp左右，Tm 62度左右，另外一种25bp左右， Tm 69度左右。
对于第一种引物，三步法PCR，退火温度58度，延伸时间2.5 min；第二种引物，两步法
，退火、延伸温度68度，时间3min。

【在 c******r 的大作中提到】

: 引物和PCR条件是啥？
: 基本参数要告诉大家吧

c*y2011-05-23 07:05

28 楼

加点他们家附带的那个 GC Enhancer 试试，有时候很管用

【在 a*****f 的大作中提到】

c*r2011-05-23 07:05

29 楼

用第二种25bp的再试一下。PCR改用三步，annealing temperature改用60度，64度分别
试一下。68做有点太高了。一般都建议是Tm减5度的。
这个pcr看起来比较直接啊，不行就多试几个不同的pcr annealing temperature就可以啦

【在 a*****f 的大作中提到】

: 引物设计了两种，一种21bp左右，Tm 62度左右，另外一种25bp左右， Tm 69度左右。
: 对于第一种引物，三步法PCR，退火温度58度，延伸时间2.5 min；第二种引物，两步法
: ，退火、延伸温度68度，时间3min。

i*52011-05-23 07:05

30 楼

dilute your template. dilute your template. often times, genomic DNA
solution contains tons of chemicals and proteins which are inhibitors of
your PCR

【在 a*****f 的大作中提到】

s*y2011-05-23 07:05

31 楼

对，应该用一个gradient 来测一下不同的annealing temp.

以啦

【在 c******r 的大作中提到】

: 用第二种25bp的再试一下。PCR改用三步，annealing temperature改用60度，64度分别
: 试一下。68做有点太高了。一般都建议是Tm减5度的。
: 这个pcr看起来比较直接啊，不行就多试几个不同的pcr annealing temperature就可以啦

s*82011-05-23 07:05

32 楼

genomic DNA solution contains tons of chemicals and proteins which are
inhibitors of
这个怎么讲？

s*82011-05-23 07:05

33 楼

搭车问..最近也在做一个genomic PCR，5k的片段，用的是Pfuultra II HS fusion (
from agilent),怎么也P不出5k的片段，只有4k，3k的条带。。。
试了gradient，还是那几条带。
两条引物中的一条有mispriming，是应该换引物吗？还是换酶？

w*d2011-05-23 07:05

34 楼

一点建议。
1.买一个BAC作模板。
2.或者先PCR两个1K的片段，然后再做1次2K的PCR。
3.或者连续做两次PCR。把第一次的产物稀释1000倍，然后做第二次的底物。

k*l2011-05-23 07:05

35 楼

How do you know your template is OK? and in the right amount?
Try amplifying 200bp as positive control

e*e2011-05-23 07:05

36 楼

另一个替代的方法是能不能改用BAC/PAC为模板，如果你能找到容纳有你需要扩增的
基因的BAC/PAC质粒，用qiagen的kit纯化，这样模板的质量可以保证。我用这个方法扩
增出来长达8k的基因。

Z*52011-05-23 07:05

37 楼

先找个阳性引物，测试你的模板没问题。
如果模板没问题，可以试试tuch down。

i*g2011-05-23 07:05

38 楼

加DMSO 可以到10%，
以前PCR过一个cDNA， N端严重hairpin

d*u2011-05-23 07:05

39 楼

用Pfx有个非常土但很有效的办法（至少对我有效）：把所有component的浓度加倍。我
扩的是cDNA，当初用标准的Pfx protocol基本扩不出来，后来加倍浓度后几乎每次都成
功。我也用那个enhancer，但没比较过用和不用的区别。有兴趣的话我再上具体参数。

M*o2011-05-23 07:05

40 楼

帮顶下

a*f2011-05-23 07:05

41 楼

~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~求解释

【在 w*******d 的大作中提到】

: 一点建议。
: 1.买一个BAC作模板。
: 2.或者先PCR两个1K的片段，然后再做1次2K的PCR。
: 3.或者连续做两次PCR。把第一次的产物稀释1000倍，然后做第二次的底物。

a*f2011-05-23 07:05

42 楼

能不能上个具体参数，多谢了bow

【在 d******u 的大作中提到】

: 用Pfx有个非常土但很有效的办法（至少对我有效）：把所有component的浓度加倍。我
: 扩的是cDNA，当初用标准的Pfx protocol基本扩不出来，后来加倍浓度后几乎每次都成
: 功。我也用那个enhancer，但没比较过用和不用的区别。有兴趣的话我再上具体参数。

d*u2011-05-23 07:05

43 楼

cDNA (from 2ug total RNA): 5ul
10X Pfx buffer: 12.5ul
10mM dNTP: 3ul
50mM MgSO4: 2ul
Fwd primer (10uM): 2ul
Rev primer (10uM): 2ul
Platinum Pfx: 1ul
dH2O: 22.5ul
_______________________________
50ul/rxn
+10X enhancer: 5ul
PCR:
94C, 5min
__________
94C, 15sec
60C, 30sec
68C, 3min
__________35X
68C, 7min
4C, for ever
我用PrimerExpress设计引物，标准60度Tm。

s*82011-05-23 07:05

44 楼

这是个好办法，但是怎么找含有target gene 的BAC/PAC？需要screen bac/pac
library吗？

【在 e*****e 的大作中提到】

: 另一个替代的方法是能不能改用BAC/PAC为模板，如果你能找到容纳有你需要扩增的
: 基因的BAC/PAC质粒，用qiagen的kit纯化，这样模板的质量可以保证。我用这个方法扩
: 增出来长达8k的基因。

o*42011-05-23 07:05

45 楼

Takara的Hotprime的酶很好使，就是突变稍微比pfu高点

【在 a*****f 的大作中提到】

s*82011-05-23 07:05

46 楼

～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～～
这个具体怎么操作？哪位大牛来给解释一下？？？

【在 w*******d 的大作中提到】

h*62011-05-23 07:05

47 楼

Do you also double the amount of buffer? How about template?

【在 d******u 的大作中提到】

d*u2011-05-23 07:05

48 楼

上面已经把所有参数给出来了。
模板是用的从2ug total RNA做的20ul RT reaction中用5ul。别的模板titration没做
过。

G*h2011-05-23 07:05

49 楼

2-kb with 44% GC should not be too difficult. Below are what I can think of
at the moment:
1) There may be a very difficult secondary structure in the sequence (such
as an inverted repeat). If there is
indeed an inverted repeat, you have to run two separate PCR and then ligate
your two product together.
2) Some other secondary structure problems can be resolved by designing
longer primers, so you can have a
higher annealing temperature to overcome the problem.
3) Your template DNA is degraded, so basically, no template. You can try to
PCR any fragment that worked
before to test it out.
4) Something is wrong with your PCR system (bad PCR machine or reagents).
Again, run a positive control
PCR as suggested above in #3. If PCR machine has not been calibrated for a
long time, temperatures may
not reach to a desired one at a desired time.
5) In general, a few degree difference in annealing temperature may give you
different PCR efficiencies,
rather than a complete failure.
6) Double check your sequence. Is your sequence really present in the genome
of your interest? Did you use
the wrong template (such as gDNA isloated another species)? Again, this can
be checked out by a positive
control PCR in #3.
Good luck!

【在 a*****f 的大作中提到】

G*h2011-05-23 07:05

50 楼

Oh, just realized from your last post that you used cDNA... In this case,
please make sure that your cDNA was
made from cells/tissues that actually express that particular gene of your
interest.
Run a positive control and see if you could amplify a smaller fragment as
suggested by someone else is a
good idea.

of
ligate
to

【在 G*****h 的大作中提到】

: 2-kb with 44% GC should not be too difficult. Below are what I can think of
: at the moment:
: 1) There may be a very difficult secondary structure in the sequence (such
: as an inverted repeat). If there is
: indeed an inverted repeat, you have to run two separate PCR and then ligate
: your two product together.
: 2) Some other secondary structure problems can be resolved by designing
: longer primers, so you can have a
: higher annealing temperature to overcome the problem.
: 3) Your template DNA is degraded, so basically, no template. You can try to

T*n2011-05-23 07:05

51 楼

有没有阳性对照？
没有对照的实验，一切都是浮云。

【在 a*****f 的大作中提到】