w*e
2 楼
请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
合用？
非常感谢！
sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
合用？
非常感谢！
t*r
3 楼
Co-ask.
w*e
4 楼
ding~
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用？
: 非常感谢！
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用？
: 非常感谢！
j*5
5 楼
coask
s*y
6 楼
6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
是“表面浓度”。
Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
efficiency 会是大问题。
如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用？
: 非常感谢！
而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
是“表面浓度”。
Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
efficiency 会是大问题。
如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用？
: 非常感谢！
c*2
7 楼
I'm excited now. got citi AA 75K miles and CO 50K miles. If UA also can get
50K, then that can be total > $4000 in cash value.
50K, then that can be total > $4000 in cash value.
w*e
8 楼
多谢建议！
是这个。说copy number是每个beads上要coat不同的peptide。btw有什么好方法
测peptide浓度吗？如果已知peptide的部分序列的话
这个倒不知——ab biotinylation应该有满成熟的protocol吧？问题是我希望
每个beads（1到几um直径）上coat至少1e4 peptide,最好1e5以上。。。
要做一个peptide library的话，有点担心用GST做constant tag会不会太大？
有没有可能modification-by-synthesis的方法，加入一个biotin-AA analog，只在
某个位置incorporate的？继续伤脑筋ing
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
是这个。说copy number是每个beads上要coat不同的peptide。btw有什么好方法
测peptide浓度吗？如果已知peptide的部分序列的话
这个倒不知——ab biotinylation应该有满成熟的protocol吧？问题是我希望
每个beads（1到几um直径）上coat至少1e4 peptide,最好1e5以上。。。
要做一个peptide library的话，有点担心用GST做constant tag会不会太大？
有没有可能modification-by-synthesis的方法，加入一个biotin-AA analog，只在
某个位置incorporate的？继续伤脑筋ing
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
w*3
9 楼
这怎么算的……
get
【在 c**2 的大作中提到】
: I'm excited now. got citi AA 75K miles and CO 50K miles. If UA also can get
: 50K, then that can be total > $4000 in cash value.
get
【在 c**2 的大作中提到】
: I'm excited now. got citi AA 75K miles and CO 50K miles. If UA also can get
: 50K, then that can be total > $4000 in cash value.
s*y
10 楼
如果你们有相对应的抗体的话可以简单的用免疫荧光法来测定
的确会有些大，而且会影响你的peptide comformation
有某些特定的氨基酸可以，比方说lysine （侧链被biotinlylated) 我忘记是
哪个公司有生产的了。你可以去骨狗一下。
不过，事先得警告一下，这个肯定会影响你的peptide构型。除非你故意把lysine
放在所有peptide 最后一位。
【在 w******e 的大作中提到】
: 多谢建议！
:
: 是这个。说copy number是每个beads上要coat不同的peptide。btw有什么好方法
: 测peptide浓度吗？如果已知peptide的部分序列的话
: 这个倒不知——ab biotinylation应该有满成熟的protocol吧？问题是我希望
: 每个beads（1到几um直径）上coat至少1e4 peptide,最好1e5以上。。。
: 要做一个peptide library的话，有点担心用GST做constant tag会不会太大？
: 有没有可能modification-by-synthesis的方法，加入一个biotin-AA analog，只在
: 某个位置incorporate的？继续伤脑筋ing
r*b
11 楼
我有收到寄来邀请，网上好像没看到。
【在 f*****a 的大作中提到】
: RT
w*e
12 楼
多谢！！
【在 s******y 的大作中提到】
:
: 如果你们有相对应的抗体的话可以简单的用免疫荧光法来测定
: 的确会有些大，而且会影响你的peptide comformation
: 有某些特定的氨基酸可以，比方说lysine （侧链被biotinlylated) 我忘记是
: 哪个公司有生产的了。你可以去骨狗一下。
: 不过，事先得警告一下，这个肯定会影响你的peptide构型。除非你故意把lysine
: 放在所有peptide 最后一位。
【在 s******y 的大作中提到】
:
: 如果你们有相对应的抗体的话可以简单的用免疫荧光法来测定
: 的确会有些大，而且会影响你的peptide comformation
: 有某些特定的氨基酸可以，比方说lysine （侧链被biotinlylated) 我忘记是
: 哪个公司有生产的了。你可以去骨狗一下。
: 不过，事先得警告一下，这个肯定会影响你的peptide构型。除非你故意把lysine
: 放在所有peptide 最后一位。
f*a
13 楼
真好!
【在 r*b 的大作中提到】
:
: 我有收到寄来邀请，网上好像没看到。
【在 r*b 的大作中提到】
:
: 我有收到寄来邀请，网上好像没看到。
o*r
14 楼
Biotinylation is too complicated to do in your case, which modifies primary
amine group (N-term and side
chain of lysine).
His-tag will be a good idea.
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用？
: 非常感谢！
amine group (N-term and side
chain of lysine).
His-tag will be a good idea.
【在 w******e 的大作中提到】
: 请教：用cell-free expression synthesize peptide/protein, 要求newly synthe-
: sized peptide/protein自动被immobilize到beads上，并达到尽量高的copy number。
: 最直接的方法大概是在gene里加个FLAG/HA的sequence，beads上coat FLAG/HA
: antibody。但Ab个头太大担心copy number上不去。
: 请教有什么alternative method？比如his6-peptide的coverage会不会更高？
: 比如有没有site-specific biotinylation的reagent可以跟cell-free expression
: 合用？
: 非常感谢！
s*8
15 楼
UA 的这个50K bonus的卡还不好啊？年费95很贵的啊，有必要申请 吗？
o*r
16 楼
For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
50 mM) when binding to the Ni
beads, almost no non-specifical binding will be observed.
And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
for denatured protein.
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
50 mM) when binding to the Ni
beads, almost no non-specifical binding will be observed.
And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
for denatured protein.
【在 s******y 的大作中提到】
: 6xHis 不是一个好选择，因为非特异结合非常严重（其实也不是真的非特异，
: 而是细胞裂解液里的好多蛋白本身就能结合金属离子）
: 你说的copy number, 是指每个bead 上被固定的多肽的数目吧？这个应该说
: 是“表面浓度”。
: Antibody 的个头其实不是问题（再怎么大也超不过20nm)，而是cross-linking
: efficiency 会是大问题。
: 如果这个对你们真的很重要的话，可以用GST-fusion protein + Glutathione-beads
b*t
17 楼
targeted
no annual fee
no annual fee
w*e
18 楼
Thanks! have you tried strept II tag BTW? bumped into it when googling
10-
used
【在 o*****r 的大作中提到】
: For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
: 50 mM) when binding to the Ni
: beads, almost no non-specifical binding will be observed.
: And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
: for denatured protein.
10-
used
【在 o*****r 的大作中提到】
: For the his-tagged protein, if you add imidazole in your sample (usually 10-
: 50 mM) when binding to the Ni
: beads, almost no non-specifical binding will be observed.
: And his-tag is usually better than GST-tag: 1. it's small; 2. it can be used
: for denatured protein.
j*5
19 楼
can you provide the link?
【在 r*b 的大作中提到】
:
: 我有收到寄来邀请，网上好像没看到。
【在 r*b 的大作中提到】
:
: 我有收到寄来邀请，网上好像没看到。
o*r
20 楼
Strep II tag is similar to his-tag, both are very small and specific.
I have not used it before, but I think it's a good system.
【在 w******e 的大作中提到】
: Thanks! have you tried strept II tag BTW? bumped into it when googling
:
: 10-
: used
I have not used it before, but I think it's a good system.
【在 w******e 的大作中提到】
: Thanks! have you tried strept II tag BTW? bumped into it when googling
:
: 10-
: used
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