c*n
2 楼
太赤裸裸了， 完全就是老墨的共产党宣言吗， 要废除illegal immigrants, 全部共产
， 老黑用枪砸开人家玻璃被冠冕堂皇地当成光辉形象宣传
这个国家在我们退休之前肯定共产化 欧洲化
， 老黑用枪砸开人家玻璃被冠冕堂皇地当成光辉形象宣传
这个国家在我们退休之前肯定共产化 欧洲化
m*d
3 楼
这15%是搞不到了
q*0
4 楼
最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
)的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
transfection efficiency consistency更好？
)的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
transfection efficiency consistency更好？
d*y
5 楼
我就写5个月
【在 a*****s 的大作中提到】
: 五个多月不到六个月，表上填5，还是算成5点几，还是6？
【在 a*****s 的大作中提到】
: 五个多月不到六个月，表上填5，还是算成5点几，还是6？
k*o
6 楼
why?
m*5
7 楼
我也不大懂这个系统，借地问两句，听说现在有一种说法是这种实验如果作为主体很容
易被打回来，因为不是很科学的系统。 好文章现在这种实验都是藏在一个小pannel里
佐证一下
易被打回来，因为不是很科学的系统。 好文章现在这种实验都是藏在一个小pannel里
佐证一下
b*c
8 楼
why?
q*0
9 楼
我自己的切身体会也感觉到这个系统不科学，首先就不能保证几个plasmids进入同一个
细胞。
【在 m******5 的大作中提到】
: 我也不大懂这个系统，借地问两句，听说现在有一种说法是这种实验如果作为主体很容
: 易被打回来，因为不是很科学的系统。 好文章现在这种实验都是藏在一个小pannel里
: 佐证一下
细胞。
【在 m******5 的大作中提到】
: 我也不大懂这个系统，借地问两句，听说现在有一种说法是这种实验如果作为主体很容
: 易被打回来，因为不是很科学的系统。 好文章现在这种实验都是藏在一个小pannel里
: 佐证一下
m*d
10 楼
终于进去了，这个如果能拿到那15%，最后才是99，否则就是116
【在 k*****o 的大作中提到】
: why?
【在 k*****o 的大作中提到】
: why?
b*8
11 楼
顶楼主，我做dual luciferase reporter好久了，也碰到跟你一模一样的问题。我感觉
这套系统真的很不stable，因此不是很reliable，那些通过dual luciferase reporter
就能找到一个关键的cis elenmentary sequences的paper，让我看的好生羡慕和佩服啊
，我自己做promoter和3‘UTR的dual luciferase reporter，出来的数据从来都是忽高
忽低的，就算有差异，也只有40%左右，根本做不到人家paper上的那么significantly
。
这套系统真的很不stable，因此不是很reliable，那些通过dual luciferase reporter
就能找到一个关键的cis elenmentary sequences的paper，让我看的好生羡慕和佩服啊
，我自己做promoter和3‘UTR的dual luciferase reporter，出来的数据从来都是忽高
忽低的，就算有差异，也只有40%左右，根本做不到人家paper上的那么significantly
。
q*0
12 楼
说实话,我现在就是在重复一个paper的结果,用的是一模一样的试验系统(除培养基
brand),但就是重复不出来,我的也是忽高忽低,一点也不consistency.真是纳闷的很呢,
请这方面有经验的高人指导一下吧,怎样做出稳定的数据呢?
reporter
significantly
【在 b**********8 的大作中提到】
: 顶楼主，我做dual luciferase reporter好久了，也碰到跟你一模一样的问题。我感觉
: 这套系统真的很不stable，因此不是很reliable，那些通过dual luciferase reporter
: 就能找到一个关键的cis elenmentary sequences的paper，让我看的好生羡慕和佩服啊
: ，我自己做promoter和3‘UTR的dual luciferase reporter，出来的数据从来都是忽高
: 忽低的，就算有差异，也只有40%左右，根本做不到人家paper上的那么significantly
: 。
brand),但就是重复不出来,我的也是忽高忽低,一点也不consistency.真是纳闷的很呢,
请这方面有经验的高人指导一下吧,怎样做出稳定的数据呢?
reporter
significantly
【在 b**********8 的大作中提到】
: 顶楼主，我做dual luciferase reporter好久了，也碰到跟你一模一样的问题。我感觉
: 这套系统真的很不stable，因此不是很reliable，那些通过dual luciferase reporter
: 就能找到一个关键的cis elenmentary sequences的paper，让我看的好生羡慕和佩服啊
: ，我自己做promoter和3‘UTR的dual luciferase reporter，出来的数据从来都是忽高
: 忽低的，就算有差异，也只有40%左右，根本做不到人家paper上的那么significantly
: 。
z*i
13 楼
我们主要是做细胞方面的东西，reporter assay也做的比较多，经常会遇到你说的这种
情况，我个人觉得是transfection的影响，就是用空质粒补平了，也会出现。有这种情
况，在转染试剂一定量得情况下，共转两个质粒，一个质粒单转+空载体补平，你会发
现共转的表达强。
所以需要用其它的质粒去normalize。一般这种实验不是主要data，重复几次结果一致
就可以了。
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
情况，我个人觉得是transfection的影响，就是用空质粒补平了，也会出现。有这种情
况，在转染试剂一定量得情况下，共转两个质粒，一个质粒单转+空载体补平，你会发
现共转的表达强。
所以需要用其它的质粒去normalize。一般这种实验不是主要data，重复几次结果一致
就可以了。
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
z*i
14 楼
你可以做IF染色看一下就知道了，基本上都是共转的，虽然其中的原理并不知道，所以
这个问题不用担心。
我们做stable cell lines的时候，载体上并没有抗性基因，就是共转一个抗性基因，
然后用药去筛，挑几个克隆，90%以上的都能表达。
【在 q**********0 的大作中提到】
: 我自己的切身体会也感觉到这个系统不科学，首先就不能保证几个plasmids进入同一个
: 细胞。
这个问题不用担心。
我们做stable cell lines的时候，载体上并没有抗性基因，就是共转一个抗性基因，
然后用药去筛，挑几个克隆，90%以上的都能表达。
【在 q**********0 的大作中提到】
: 我自己的切身体会也感觉到这个系统不科学，首先就不能保证几个plasmids进入同一个
: 细胞。
B*o
15 楼
我觉得你如果对共转染的数据不是很有信心的话，可以先转一个质粒，然后reseed细胞
，再转你要表达的蛋白。读值的时候用蛋白量来normalization。这样也是可以的
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
，再转你要表达的蛋白。读值的时候用蛋白量来normalization。这样也是可以的
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
b*8
16 楼
你这个方法也是解决问题的一个办法，不过如果表达的外源蛋白对细胞的增殖有影响的
话，最终导致细胞数不一致，所以提取的总蛋白量也不一致，这样还可以来做
normalization吗？另外你这里说的蛋白量是蛋白浓度吗？还是其他？
【在 B******o 的大作中提到】
: 我觉得你如果对共转染的数据不是很有信心的话，可以先转一个质粒，然后reseed细胞
: ，再转你要表达的蛋白。读值的时候用蛋白量来normalization。这样也是可以的
B*o
17 楼
第一次转染的时候用的reporter plasmid，reseed时候所有well里已经转染的细胞数是
一致的。第二次转染的时候再转你的transcription factor，即使它会促进细胞增殖，
我觉得不会对结果有多大影响，毕竟你的TF如果activate luciferase expression，差
别那是相当大(suppose你24 or 48hr收样品).细胞增殖的过程实际是你的vector在细胞
里被稀释过程，按照你的说法control background luciferase是应该降低的，如果在
这种情况下你能看到明显的activation，那一定是真的对吧
normalization可以用蛋白浓度(前提是上一样的量),和用上样的总蛋白量其实是一样的
道理
只是俺的拙见
【在 b**********8 的大作中提到】
:
: 你这个方法也是解决问题的一个办法，不过如果表达的外源蛋白对细胞的增殖有影响的
: 话，最终导致细胞数不一致，所以提取的总蛋白量也不一致，这样还可以来做
: normalization吗？另外你这里说的蛋白量是蛋白浓度吗？还是其他？
一致的。第二次转染的时候再转你的transcription factor，即使它会促进细胞增殖，
我觉得不会对结果有多大影响，毕竟你的TF如果activate luciferase expression，差
别那是相当大(suppose你24 or 48hr收样品).细胞增殖的过程实际是你的vector在细胞
里被稀释过程，按照你的说法control background luciferase是应该降低的，如果在
这种情况下你能看到明显的activation，那一定是真的对吧
normalization可以用蛋白浓度(前提是上一样的量),和用上样的总蛋白量其实是一样的
道理
只是俺的拙见
【在 b**********8 的大作中提到】
:
: 你这个方法也是解决问题的一个办法，不过如果表达的外源蛋白对细胞的增殖有影响的
: 话，最终导致细胞数不一致，所以提取的总蛋白量也不一致，这样还可以来做
: normalization吗？另外你这里说的蛋白量是蛋白浓度吗？还是其他？
q*0
18 楼
谢谢回复！我也正想作个IF试试，只是很好奇，为什么所有plasmid倾向进入同一个细
胞。
【在 z********i 的大作中提到】
: 你可以做IF染色看一下就知道了，基本上都是共转的，虽然其中的原理并不知道，所以
: 这个问题不用担心。
: 我们做stable cell lines的时候，载体上并没有抗性基因，就是共转一个抗性基因，
: 然后用药去筛，挑几个克隆，90%以上的都能表达。
胞。
【在 z********i 的大作中提到】
: 你可以做IF染色看一下就知道了，基本上都是共转的，虽然其中的原理并不知道，所以
: 这个问题不用担心。
: 我们做stable cell lines的时候，载体上并没有抗性基因，就是共转一个抗性基因，
: 然后用药去筛，挑几个克隆，90%以上的都能表达。
q*0
19 楼
谢谢回复！如果先将报告基因转染，在reseed细胞时，该plasmid可能会丢失的，又怎
么能观察到目的蛋白对报告基因启动子的影响呢?况且如果不同时转染的话，怎么能保
证两个plasmids进入同一个细胞呢？
【在 B******o 的大作中提到】
: 我觉得你如果对共转染的数据不是很有信心的话，可以先转一个质粒，然后reseed细胞
: ，再转你要表达的蛋白。读值的时候用蛋白量来normalization。这样也是可以的
么能观察到目的蛋白对报告基因启动子的影响呢?况且如果不同时转染的话，怎么能保
证两个plasmids进入同一个细胞呢？
【在 B******o 的大作中提到】
: 我觉得你如果对共转染的数据不是很有信心的话，可以先转一个质粒，然后reseed细胞
: ，再转你要表达的蛋白。读值的时候用蛋白量来normalization。这样也是可以的
r*d
20 楼
我也被同样的问题困扰。。
我不用转染TF,只是加药。。结果加了药以后renilla的读数成比例的上升，导致
firefly/renilla的比例还是不变甚至下降。我看到有些CELL paper,就直接做firefly,
不做renilla...
但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低
【在 q**********0 的大作中提到】
: 谢谢回复！如果先将报告基因转染，在reseed细胞时，该plasmid可能会丢失的，又怎
: 么能观察到目的蛋白对报告基因启动子的影响呢?况且如果不同时转染的话，怎么能保
: 证两个plasmids进入同一个细胞呢？
我不用转染TF,只是加药。。结果加了药以后renilla的读数成比例的上升，导致
firefly/renilla的比例还是不变甚至下降。我看到有些CELL paper,就直接做firefly,
不做renilla...
但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低
【在 q**********0 的大作中提到】
: 谢谢回复！如果先将报告基因转染，在reseed细胞时，该plasmid可能会丢失的，又怎
: 么能观察到目的蛋白对报告基因启动子的影响呢?况且如果不同时转染的话，怎么能保
: 证两个plasmids进入同一个细胞呢？
W*9
21 楼
use B=gal as control
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
w*e
22 楼
我前段时间刚遇到过同样的问题。换成CMV promoter的renilla 会好很多。个人认为
我们研究的蛋白对TK promoter 有一定的特异激活作用。希望对你有帮助。
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
我们研究的蛋白对TK promoter 有一定的特异激活作用。希望对你有帮助。
【在 q**********0 的大作中提到】
: 最近用共转染实验检测一蛋白对某promoter(firefly luciferase reporter
: )的激活作用。按照惯例，用Renilla Luciferase (TK promoter)作transfection
: efficiency control，但确发现Renilla control老是和firefly成比例的增高或降低，
: 查文献，没有任何线索表明会TK promoter被我们所调查的蛋白激活，以前用共转染实
: 验检测另一蛋白也遇到相似的问题，似乎这种体外表达的蛋白对任何一种promoter都有
: 非特异的激活or抑制，不知版上同仁是否遇到同样问题？用其他什么办法控制
: transfection efficiency consistency更好？
f*n
23 楼
我做过一次，制备了个稳定转染的细胞系（REPORT和目的质粒双转染）。
问题是只能用很短时间，然后数据就误差很大很大了。
是不是双转染不稳定，只能维持很短时间呢？
问题是只能用很短时间，然后数据就误差很大很大了。
是不是双转染不稳定，只能维持很短时间呢？
y*6
24 楼
Use CMV-gal as control.
q*0
25 楼
谢谢以上各位的回复。我也正想用CMV-Reilla试试，希望它不受目的蛋白的影响。
我们转染的目的蛋白和报告基因都是瞬时表达体系，不会整合进宿主基因。所以变异可
能还来自实验系统本身。对于稳定转染的细胞系，是否转染的目的蛋白和报告基因已经
丢失掉？
我们转染的目的蛋白和报告基因都是瞬时表达体系，不会整合进宿主基因。所以变异可
能还来自实验系统本身。对于稳定转染的细胞系，是否转染的目的蛋白和报告基因已经
丢失掉？
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