某些蛋白做不出WB，如何解释？ - 未名空间MITBBS历史存档

某些蛋白做不出WB，如何解释？# Biology - 生物学

r*o2011-10-11 07:10

1 楼

【以下文字转载自 Linux 讨论区】
发信人: roufoo (五经勤向窗前读), 信区: Linux
标题: 问道OS的面试题。
发信站: BBS 未名空间站 (Thu Apr 22 22:03:27 2010, 美东)
fork一个进程的时候，内核里面发生了什么？
我前天被问到这道题目，我只知道子进程会拷贝父进程的内核空间，结果答的很烂。请
问这里的大牛，这道题应该怎么回答比较好？
多谢！

m*d2011-10-11 07:10

2 楼

【以下文字转载自 Military 讨论区】
发信人: superphase (多情应笑我), 信区: Military
标题: 模拟涛哥的韩峰体日记
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Mar 26 04:04:58 2010, 美东)
上午没事，吃了中饭，和老同志开会，老江太讨厌，竟然要我等．外间传丫挂了，这事
组织上也快要提上议事日程。老温下午又上人民网聊天，
被网民骂，也难怪，一句话说三年。烦。

n*o2011-10-11 07:10

3 楼

春节又要来了，情人节也快要来了。
是不是还是一个人过？
是不是努力去参加活动，认识了一些人，
但是过后，还是没有交集？
是不是在网络上努力灌水搭讪，
认识了他/她，
可是依然在犹犹豫豫、忐忐忑忑之间，
缘分还是会悄悄地溜过？
他/她还是那么遥远不可及？
是不是在无数次憧憬向往、努力追求之后，
总是失望、失落、还有挫败感？
为什么？时代变了？我们变了？
大学时候为什么能够不计较身份、收入、身高体重、长相等，
去甜蜜地喜欢一个人呢？
因为那时候单纯，也因为那时候有了同窗相处的感情。
如今，海外漂泊岁月里存在着现实空间的限制，
我们没有同窗时候数年的相处相知机会，
所以，爱情就更多地和长相、身高、体重、收入、身份挂上了钩。
那我们该怎么办呢？
我想有个家俱乐部，就是为了给大岭单身一个更真诚的平台，
来探讨男人和女人之间，如何增进相互了解、理解，
进而增加相爱、相惜、相守的机会，

p*t2011-10-11 07:10

4 楼

看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。

k*e2011-10-11 07:10

5 楼

detailed answer can be found in understanding linux kernel

A*y2011-10-11 07:10

6 楼

Usually is the antibody that is not good enough, and to find a good one
could be costly (~$300 a try if no one have one lying around in the lab).
Yes, RT-PCR is completely B.S., also transcription regulation are mostly
long term responses...most pathways are not through transcription regulation
.

r*o2011-10-11 07:10

7 楼

大侠你怎么什么都精通啊，呵呵。

【在 k***e 的大作中提到】

: detailed answer can be found in understanding linux kernel

s*s2011-10-11 07:10

8 楼

没有抗体很正常啊。比如我们实验室原来有个蛋白，各个实验室做了超过10年了，
就我们实验室自己都各种方法的抗体做了有十个了，没有一个work的

【在 p********t 的大作中提到】

: 看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
: 最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
: PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。

k*e2011-10-11 07:10

9 楼

不算精通
这些都是死记硬背
你必须知道fork后那些和parent share 哪些是child特有的
真的牛人可以从汇编跳转设置ldt gdt什么的这些开始讲起里面的东西海了去了
没做过项目很容易被人问露馅
问到os方面的问题不熟悉就承认不然随随便便就被人问趴下

【在 r****o 的大作中提到】

: 大侠你怎么什么都精通啊，呵呵。

v*a2011-10-11 07:10

10 楼

是啊说到这个我就很伤心现在在做的一个蛋白外面的抗体买了5个自己做了2个
都不行发表paper的时候看来也能用PCR充数了

【在 s******s 的大作中提到】

: 没有抗体很正常啊。比如我们实验室原来有个蛋白，各个实验室做了超过10年了，
: 就我们实验室自己都各种方法的抗体做了有十个了，没有一个work的

w*l2011-10-11 07:10

11 楼

这个问题太笼统了，没什么信息量。内核里基本就是copy所有的进程相关的数据结构。

【在 r****o 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 Linux 讨论区】
: 发信人: roufoo (五经勤向窗前读), 信区: Linux
: 标题: 问道OS的面试题。
: 发信站: BBS 未名空间站 (Thu Apr 22 22:03:27 2010, 美东)
: fork一个进程的时候，内核里面发生了什么？
: 我前天被问到这道题目，我只知道子进程会拷贝父进程的内核空间，结果答的很烂。请
: 问这里的大牛，这道题应该怎么回答比较好？
: 多谢！

s*p2011-10-11 07:10

12 楼

同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。

【在 v***a 的大作中提到】

: 是啊说到这个我就很伤心现在在做的一个蛋白外面的抗体买了5个自己做了2个
: 都不行发表paper的时候看来也能用PCR充数了

w*l2011-10-11 07:10

13 楼

linux不用段，所以段表都是不动的--只有一个表，但是这题没限定是linux，所以属于
比较扯的那种open题目。这里面比较有意思的是copy页表设置copy on write。如果是
我的话可能会问问cow可能的实现方法。另外一个稍微比较没意思的问点是，如果让你
做决定，parent和child哪个先从系统调用返回，为什么。

【在 k***e 的大作中提到】

: 不算精通
: 这些都是死记硬背
: 你必须知道fork后那些和parent share 哪些是child特有的
: 真的牛人可以从汇编跳转设置ldt gdt什么的这些开始讲起里面的东西海了去了
: 没做过项目很容易被人问露馅
: 问到os方面的问题不熟悉就承认不然随随便便就被人问趴下

O*e2011-10-11 07:10

14 楼

同伤心同伤心。我的一个蛋白也是把能买的买遍外加自己做的几个，都不行。。。

【在 v***a 的大作中提到】

: 是啊说到这个我就很伤心现在在做的一个蛋白外面的抗体买了5个自己做了2个
: 都不行发表paper的时候看来也能用PCR充数了

w*12011-10-11 07:10

15 楼

google 出来的一个解释
NAME
fork - create a child process
SYNOPSIS
#include
#include
pid_t fork(void);
DESCRIPTION
fork creates a child process that differs from the parent process only in
its PID and PPID, and in the fact that resource utilizations are set to 0.
File locks and pending signals are not inherited.
Under Linux, fork is implemented using copy-on-write pages, so the only
penalty incurred by fork is the time and memory required to duplicate the
parent's page tables, a

h*n2011-10-11 07:10

16 楼

same here

【在 s*******p 的大作中提到】

: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。

w*12011-10-11 07:10

17 楼

GOOGLE 出来的：
fork创建一个进程时，子进程只是完全复制父进程的资源，这样得到的子进程独立于父
进程，具有良好的并发性，但是二者之间的通讯需要通过专门的通讯机制，如：pipe
，popen&pclose、协同进程、fifo，System V IPC（消息队列、信号量和共享内存）机
制等，另外通过fork创建子进程系统开销很大，需要将上面描述的每种资源都复制一
个副本。这样看来，fork是一个开销十分大的系统调用，这些开销并不是所有的情况
下都是必须的，比如某进程fork出一个子进程后，其子进程仅仅是为了调用exec执行另
一个执行文件，那么在fork过程中对于虚存空间的复制将是一个多余的过程（由于
Linux中是采取了copy-on-write技术，所以这一步骤的所做的工作只是虚存管理部分的
复制以及页表的创建，而并没有包括物理也面的拷贝）；
vfork系统调用不同于fork，用vfork创建的子进程共享地址空间，也就是说子进程完全
运行在父进程的地址空间上，子进程对虚拟地址空间任何数据的修改同样为父进程所见
。但是用 vfork创建子进程后，父进程会被阻塞直到子进

K*S2011-10-11 07:10

18 楼

time to try MRM

【在 s*******p 的大作中提到】

: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。

s*s2011-10-11 07:10

19 楼

汇编跳转的，你看现在有几个赚大钱的？
没用的，现在的产业分工没几个公司需要这些东西了。最多把 bootup 的几段搞清楚就
够了

【在 k***e 的大作中提到】

: 不算精通
: 这些都是死记硬背
: 你必须知道fork后那些和parent share 哪些是child特有的
: 真的牛人可以从汇编跳转设置ldt gdt什么的这些开始讲起里面的东西海了去了
: 没做过项目很容易被人问露馅
: 问到os方面的问题不熟悉就承认不然随随便便就被人问趴下

c*b2011-10-11 07:10

20 楼

比较好奇的问（也包括问楼上各位）所谓不行是指没有带还是杂带很多？
我主要做的植物，很多植物都有各种各样的辣根过氧化物酶，象烟草在32Kd的地方什么
抗体都不加，用pierce的HRP的底物反应，曝光1分钟肯定有带。坑了我2年多。

【在 h*******n 的大作中提到】

: same here

s*s2011-10-11 07:10

21 楼

赞勤奋， COW 确实是很重要，关键是这种想法

pipe

【在 w******1 的大作中提到】

: GOOGLE 出来的：
: fork创建一个进程时，子进程只是完全复制父进程的资源，这样得到的子进程独立于父
: 进程，具有良好的并发性，但是二者之间的通讯需要通过专门的通讯机制，如：pipe
: ，popen&pclose、协同进程、fifo，System V IPC（消息队列、信号量和共享内存）机
: 制等，另外通过fork创建子进程系统开销很大，需要将上面描述的每种资源都复制一
: 个副本。这样看来，fork是一个开销十分大的系统调用，这些开销并不是所有的情况
: 下都是必须的，比如某进程fork出一个子进程后，其子进程仅仅是为了调用exec执行另
: 一个执行文件，那么在fork过程中对于虚存空间的复制将是一个多余的过程（由于
: Linux中是采取了copy-on-write技术，所以这一步骤的所做的工作只是虚存管理部分的
: 复制以及页表的创建，而并没有包括物理也面的拷贝）；

h*n2011-10-11 07:10

22 楼

很多杂带， KO里也有

l*y2011-10-11 07:10

23 楼

没必要看understanding linux kernel，很多地方都讲的太详细。
linux kernel development就很好，没那么多细节，但是重要的东西都有了。

【在 k***e 的大作中提到】

: detailed answer can be found in understanding linux kernel

c*b2011-10-11 07:10

24 楼

不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）twice, 5min each，collect supernatant leave on ice, use 1
／10 volumn Tris（pH8）neutrolize，Make sure pH around7，Per 1ml elute add 0
.4g ammonium sulfate，dissolve well，leave in 4 degree 30min，4000 rpm 30
min spin，dissolve pellet in 1 ml 1XTBS， dialysis twice against 1XTBS （6hr
each）.collect Ab and add 0.02% sodium azide.

【在 h*******n 的大作中提到】

: 很多杂带， KO里也有

r*o2011-10-11 07:10

25 楼

多谢。是不是child先从系统调用返回比较好。因为child可能会共用parent的内存空间
(如果没有write操作的话)。

【在 w*********l 的大作中提到】

: linux不用段，所以段表都是不动的--只有一个表，但是这题没限定是linux，所以属于
: 比较扯的那种open题目。这里面比较有意思的是copy页表设置copy on write。如果是
: 我的话可能会问问cow可能的实现方法。另外一个稍微比较没意思的问点是，如果让你
: 做决定，parent和child哪个先从系统调用返回，为什么。

p*t2011-10-11 07:10

26 楼

看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。

w*l2011-10-11 07:10

27 楼

个人认为啊，看lkd还不如看操作系统教科书。ulk还好，真做东西的话其实这本书讲的
还是不够细。

【在 l*******y 的大作中提到】

: 没必要看understanding linux kernel，很多地方都讲的太详细。
: linux kernel development就很好，没那么多细节，但是重要的东西都有了。

A*y2011-10-11 07:10

28 楼

Usually is the antibody that is not good enough, and to find a good one
could be costly (~$300 a try if no one have one lying around in the lab).
Yes, RT-PCR is completely B.S., also transcription regulation are mostly
long term responses...most pathways are not through transcription regulation
.

l*y2011-10-11 07:10

29 楼

真做东西当然是不够的，不过对于找工作对付面试我觉得已经够了
lkd和专门的操作系统书还是不一样的吧，我觉得linux那个O(1) 的 process
scheduling algorithm 操作系统书里应该没有把（我也不确定），因为这个具体的实
现不同的OS算法不一样的吧。

【在 w*********l 的大作中提到】

: 个人认为啊，看lkd还不如看操作系统教科书。ulk还好，真做东西的话其实这本书讲的
: 还是不够细。

s*s2011-10-11 07:10

30 楼

没有抗体很正常啊。比如我们实验室原来有个蛋白，各个实验室做了超过10年了，
就我们实验室自己都各种方法的抗体做了有十个了，没有一个work的

【在 p********t 的大作中提到】

: 看到不少文章中把蛋白的功能都做了一大堆了，且符合大家对这个蛋白特性的共识。但
: 最后都不能证明这个蛋白在这个组织里确实有表达，至少show个WB的图吧。结果拿个
: PCR充个数。这怎么解释呢？就是没有合适抗体？让我如何相信啊。

v*a2011-10-11 07:10

31 楼

是啊说到这个我就很伤心现在在做的一个蛋白外面的抗体买了5个自己做了2个
都不行发表paper的时候看来也能用PCR充数了

【在 s******s 的大作中提到】

: 没有抗体很正常啊。比如我们实验室原来有个蛋白，各个实验室做了超过10年了，
: 就我们实验室自己都各种方法的抗体做了有十个了，没有一个work的

s*p2011-10-11 07:10

32 楼

同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。

【在 v***a 的大作中提到】

: 是啊说到这个我就很伤心现在在做的一个蛋白外面的抗体买了5个自己做了2个
: 都不行发表paper的时候看来也能用PCR充数了

O*e2011-10-11 07:10

33 楼

同伤心同伤心。我的一个蛋白也是把能买的买遍外加自己做的几个，都不行。。。

【在 v***a 的大作中提到】

: 是啊说到这个我就很伤心现在在做的一个蛋白外面的抗体买了5个自己做了2个
: 都不行发表paper的时候看来也能用PCR充数了

h*n2011-10-11 07:10

34 楼

same here

【在 s*******p 的大作中提到】

: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。

K*S2011-10-11 07:10

35 楼

time to try MRM

【在 s*******p 的大作中提到】

: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。

c*b2011-10-11 07:10

36 楼

比较好奇的问（也包括问楼上各位）所谓不行是指没有带还是杂带很多？
我主要做的植物，很多植物都有各种各样的辣根过氧化物酶，象烟草在32Kd的地方什么
抗体都不加，用pierce的HRP的底物反应，曝光1分钟肯定有带。坑了我2年多。

【在 h*******n 的大作中提到】

: same here

h*n2011-10-11 07:10

37 楼

很多杂带， KO里也有

c*b2011-10-11 07:10

38 楼

不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
－tag提出来的多。
要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
特异。还有就是不太适用于IP。
这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，
Wash with 1XTBS（contains 0.02％ sodium azide) twice, 10 min each，Elute
with glycine（pH3）twice, 5min each，collect supernatant leave on ice, use 1
／10 volumn Tris（pH8）neutrolize，Make sure pH around7，Per 1ml elute add 0
.4g ammonium sulfate，dissolve well，leave in 4 degree 30min，4000 rpm 30
min spin，dissolve pellet in 1 ml 1XTBS， dialysis twice against 1XTBS （6hr
each）.collect Ab and add 0.02% sodium azide.

【在 h*******n 的大作中提到】

: 很多杂带， KO里也有

c*g2011-10-11 07:10

39 楼

我们经常做2个不同tag的表达，一个immno rabbat；一个来purify IgG。

his

【在 c********b 的大作中提到】

: 不知道大家是怎么纯化抗体的，挂IgG的proein A柱子得到的肯定不纯。
: 如果是用antigen－affinity purification就会好很多。只是有时候那个his－tag还是
: 会干扰。一个师兄教我先用一个带HIS6的无关蛋白把non-specific的先去掉（比如
: sunnyday最喜欢的actin就被我加了his6来干这事），然后再来做antigen－affinity。
: 如果是intein－tag提出来的这一步都可以省掉，只是intein得到的蛋白量好像没有his
: －tag提出来的多。
: 要提到的是这个protocol在我手上得到的抗体浓度很低，我一般用1：100稀释，但是很
: 特异。还有就是不太适用于IP。
: 这个方法不用挂柱子，跑SDS－PAGE，直接转到膜上，block之后先把血清和actin－
: his6（in my case）的膜放2hr，然后上清拿出来和block过的antigen的膜泡2hr，

c*g2011-10-11 07:10

40 楼

confirm ur KO mice once again.

【在 s*******p 的大作中提到】

: 同伤心，我们在一个抗体上也花了几千块，更可气的是买了一个著名公司的抗体，带很
: 特异，而且大小正确，结果用knockout 老鼠鉴定发现不对。

h*o2011-10-11 07:10

41 楼

I agree.
Usually if an antibody from a reliable vendor yields such specific band, I
will double check with the mouse colony.
Also, if the purified protein/peptide is available, I will try pre-absorbed
antibody as a negative control.

【在 c****g 的大作中提到】

: confirm ur KO mice once again.

n*k2011-10-11 07:10

42 楼

I literally spent at least 20k and a half year to work out one staining....after several
others tried for several months to year...Now, people are asking for my
protocols just like that without least appreciation of how much I have put
into it...

【在 O******e 的大作中提到】

: 同伤心同伤心。我的一个蛋白也是把能买的买遍外加自己做的几个，都不行。。。