用CRISPR建stable cell line# Biology - 生物学
C*3
1 楼
请问AOS期间EAD/AP renew从递交材料到批准的这1-2个月，申请人都必须在美国吗？递
材料的
时候在，批准的时候不在行不行？
谢谢
材料的
时候在，批准的时候不在行不行？
谢谢
c*1
2 楼
以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
做。
先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
很多。
后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
transfection，通常每个细胞的plasmid会很多，这样Cas9的量太高了，会不会又会增
加off target的概率？
大家一般是首选什么策略？
做。
先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
很多。
后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
transfection，通常每个细胞的plasmid会很多，这样Cas9的量太高了，会不会又会增
加off target的概率？
大家一般是首选什么策略？
t*k
3 楼
mark一下，也在原代细胞里面做
a*n
4 楼
也可以用别的不整合的virus
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
h*y
5 楼
可以考虑用Cas9的mRNA
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
a*a
6 楼
gRNA不用lenti不就行了
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
O*l
7 楼
干嘛这么麻烦，用CRISPR质粒 （px330系列）transient表达Cas9和gRNA，同时转两个
，KO效率还是很高的。
如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
整合效率不高。
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
，KO效率还是很高的。
如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
整合效率不高。
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
d*i
8 楼
没做过，弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone？
【在 O*****l 的大作中提到】
: 干嘛这么麻烦，用CRISPR质粒 （px330系列）transient表达Cas9和gRNA，同时转两个
: ，KO效率还是很高的。
: 如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
: 整合效率不高。
【在 O*****l 的大作中提到】
: 干嘛这么麻烦，用CRISPR质粒 （px330系列）transient表达Cas9和gRNA，同时转两个
: ，KO效率还是很高的。
: 如果要做整合，用lenti表达Cas9, 再转入gRNA就是了。不过lenti-Cas9的titer较低，
: 整合效率不高。
G*s
9 楼
Tet-on promoter does NOT work very well.
O*l
10 楼
共转带Puro／GFP的质粒，用单个Crispr的1:4甚至更少，然后筛选。
【在 d****i 的大作中提到】
: 没做过，弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone？
【在 d****i 的大作中提到】
: 没做过，弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone？
z*t
11 楼
楼主如果细胞能够进行单细胞筛选，那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP
complex
这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
complex
这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
c*1
12 楼
具体怎么做？人工合成sgRNA，重组的Cas9?
有参考文献或者protocol么？多谢！！
effiency
【在 z*t 的大作中提到】
: 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选，那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP
: complex
: 这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
: 存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency
有参考文献或者protocol么？多谢！！
effiency
【在 z*t 的大作中提到】
: 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选，那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP
: complex
: 这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
: 存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency
z*t
13 楼
我就一起说了哈，还有一个哥们问我
我们用in vitro transcribed的sgRNA+ Cas9 protein室温incubate 15min
然后加到neon transfection打电转。
Cas9 protein有家公司叫PNA bio有卖, thermo也有类似的product
https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/genome-editing/geneart-
crispr/crispr-protein.html
下面是跟我们类似的protocol
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/
synthetic-biology/pdfs/Rapid%20and%20highly%20efficient%20mammalian%20cell%
20engineering%20via%20Cas9%20protein%20transfection%20PUBLICATION.pdf
【在 c****1 的大作中提到】
: 具体怎么做？人工合成sgRNA，重组的Cas9?
: 有参考文献或者protocol么？多谢！！
:
: effiency
我们用in vitro transcribed的sgRNA+ Cas9 protein室温incubate 15min
然后加到neon transfection打电转。
Cas9 protein有家公司叫PNA bio有卖, thermo也有类似的product
https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/genome-editing/geneart-
crispr/crispr-protein.html
下面是跟我们类似的protocol
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/
synthetic-biology/pdfs/Rapid%20and%20highly%20efficient%20mammalian%20cell%
20engineering%20via%20Cas9%20protein%20transfection%20PUBLICATION.pdf
【在 c****1 的大作中提到】
: 具体怎么做？人工合成sgRNA，重组的Cas9?
: 有参考文献或者protocol么？多谢！！
:
: effiency
l*o
14 楼
这帖子要mark
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
【在 c****1 的大作中提到】
: 以前用CRISPR，都是用在原代细胞上，因为转染效率极低，所以，只有用lentivirus来
: 做。
: 先要建立几个KO的stable cell line。首先，不经过仔细思考的办法，就是用
: LentiCrispr的慢病毒来做，然后加puro筛选。但是，这个方法不好的地方是，Cas9一
: 直表达，时间长了，off target肯定会比较多。
: 后来觉得，用Tet On的promoter来控制Cas9的表达，这样只在短时间内表达，应该会好
: 很多。
: 后来再一想，这个gene edit，本来就是permanent的。没必要用lentivirus来，这
: lentivirus还会整合到genome里，顺便破坏哪个基因还不晓得。为什么不直接用
: transfection呢？唯一可能的问题就是效率可能低了点。还有可能问题的，瞬时
z*t
15 楼
是不是得打赏包子的说，嘿嘿
【在 l*****o 的大作中提到】
: 这帖子要mark
【在 l*****o 的大作中提到】
: 这帖子要mark
b*s
16 楼
赞！
搭车问一下，Crispr建立可诱导基因敲除细胞株的protocol在哪有？
谢谢！
geneart-
【在 z*t 的大作中提到】
: 我就一起说了哈，还有一个哥们问我
: 我们用in vitro transcribed的sgRNA+ Cas9 protein室温incubate 15min
: 然后加到neon transfection打电转。
: Cas9 protein有家公司叫PNA bio有卖, thermo也有类似的product
: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/genome-editing/geneart-
: crispr/crispr-protein.html
: 下面是跟我们类似的protocol
: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/
: synthetic-biology/pdfs/Rapid%20and%20highly%20efficient%20mammalian%20cell%
: 20engineering%20via%20Cas9%20protein%20transfection%20PUBLICATION.pdf
搭车问一下，Crispr建立可诱导基因敲除细胞株的protocol在哪有？
谢谢！
geneart-
【在 z*t 的大作中提到】
: 我就一起说了哈，还有一个哥们问我
: 我们用in vitro transcribed的sgRNA+ Cas9 protein室温incubate 15min
: 然后加到neon transfection打电转。
: Cas9 protein有家公司叫PNA bio有卖, thermo也有类似的product
: https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/genome-editing/geneart-
: crispr/crispr-protein.html
: 下面是跟我们类似的protocol
: https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/
: synthetic-biology/pdfs/Rapid%20and%20highly%20efficient%20mammalian%20cell%
: 20engineering%20via%20Cas9%20protein%20transfection%20PUBLICATION.pdf
z*t
17 楼
inducible目前不好做
可以稳转Cas9+ inducible sgRNA，这个是目前我觉得最靠谱的.
至于inducible Cas9之前有兄弟说了不一定work，我们的经验是还会有Cas9的leakness.
【在 b*****s 的大作中提到】
: 赞！
: 搭车问一下，Crispr建立可诱导基因敲除细胞株的protocol在哪有？
: 谢谢！
:
: geneart-
可以稳转Cas9+ inducible sgRNA，这个是目前我觉得最靠谱的.
至于inducible Cas9之前有兄弟说了不一定work，我们的经验是还会有Cas9的leakness.
【在 b*****s 的大作中提到】
: 赞！
: 搭车问一下，Crispr建立可诱导基因敲除细胞株的protocol在哪有？
: 谢谢！
:
: geneart-
c*1
18 楼
非常感谢你的建议。我看了看这个，确实不错，准备试试。
请问你用paired guide时，用的是wt cas9，还是用的Cas9 nickase mutant?
effiency
【在 z*t 的大作中提到】
: 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选，那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP
: complex
: 这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
: 存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency
请问你用paired guide时，用的是wt cas9，还是用的Cas9 nickase mutant?
effiency
【在 z*t 的大作中提到】
: 楼主如果细胞能够进行单细胞筛选，那我强烈推荐用sgRNA+Cas9 protein做RNP
: complex
: 这个complex打电转效率很高，很推荐用paired guide可以做deletion，容易探测，不
: 存在质粒系统中像楼主提到的问题，我们用CD34+细胞可以达到90%的target effiency
c*1
19 楼
两个包子已转。请查收。
【在 z*t 的大作中提到】
: 是不是得打赏包子的说，嘿嘿
【在 z*t 的大作中提到】
: 是不是得打赏包子的说，嘿嘿
m*o
20 楼
用PURO或者GFP筛选一下下，然后从剩下的里面的里面筛单克隆，效率还挺高的。不过
这都是建立在transfection效率还不错的基础上
【在 d****i 的大作中提到】
: 没做过，弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone？
这都是建立在transfection效率还不错的基础上
【在 d****i 的大作中提到】
: 没做过，弱问transient transfection之后怎么分离KO的clone？
z*t
21 楼
我们用的是wt cas9
【在 c****1 的大作中提到】
: 非常感谢你的建议。我看了看这个，确实不错，准备试试。
: 请问你用paired guide时，用的是wt cas9，还是用的Cas9 nickase mutant?
:
: effiency
【在 c****1 的大作中提到】
: 非常感谢你的建议。我看了看这个，确实不错，准备试试。
: 请问你用paired guide时，用的是wt cas9，还是用的Cas9 nickase mutant?
:
: effiency
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