t*s
2 楼
上次父母在美国延期了两次（都获得了延期批准），从13年十月住到15年四月。
这次打算让父母六月初来，入关会有问题吗？
谢谢
这次打算让父母六月初来，入关会有问题吗？
谢谢
F*e
3 楼
我们用小鼠组织做某个转录因子的ChIP，最终目标是希望能做ChIP-Seq。现在ChIP的流
程做完之后由于DNA浓度太低（0.1-0.2ng/ul by Nanodrop），不知道整个ChIP过程是
否成功，是否拿到有效的DNA片段。这个转录因子没有非常确定的target gene，所以也
无法设计引物做ChIP-PCR。请问各位，还有什么方法可以确定产物中含有富集的DNA片
段？多谢！
程做完之后由于DNA浓度太低（0.1-0.2ng/ul by Nanodrop），不知道整个ChIP过程是
否成功，是否拿到有效的DNA片段。这个转录因子没有非常确定的target gene，所以也
无法设计引物做ChIP-PCR。请问各位，还有什么方法可以确定产物中含有富集的DNA片
段？多谢！
a*k
4 楼
少年千人
青年万人
青年亿人
青年万人
青年亿人
h*s
5 楼
感觉会有问题```
m*n
6 楼
what....I mean, you do not even know what DNA sequence you want to be "
riched", how do you know they are "riched" without sequencing? Are you just
wanna generally look at what this TF binds in the whole genome, or you are
testing whether it binds to a specific gene?
Ok, 先做library来获得更多的DNA.
Then... do you know the consensus binding sequence of this TF?
If not, and given that you do not have a positive control, you really need
to send the library for deep sequencing, and compare to control IgG-ChIPed
DNA or input DNA to find the real "peaks". If you do find enriched peaks,
then go back and do ChIP-qPCR.
riched", how do you know they are "riched" without sequencing? Are you just
wanna generally look at what this TF binds in the whole genome, or you are
testing whether it binds to a specific gene?
Ok, 先做library来获得更多的DNA.
Then... do you know the consensus binding sequence of this TF?
If not, and given that you do not have a positive control, you really need
to send the library for deep sequencing, and compare to control IgG-ChIPed
DNA or input DNA to find the real "peaks". If you do find enriched peaks,
then go back and do ChIP-qPCR.
H*y
7 楼
卿粘纤人
青年贤人
青年仙人
只要不是青年闲人，青年咸人就行。
青年贤人
青年仙人
只要不是青年闲人，青年咸人就行。
t*s
8 楼
我也这么觉得。那么推到10月份怎么样？到时就在国内1年半了。至少和上次在美国的
时间持平。
【在 h****s 的大作中提到】
: 感觉会有问题```
时间持平。
【在 h****s 的大作中提到】
: 感觉会有问题```
F*e
9 楼
多谢回复。
我们就是因为没有可靠的binding site作为positive constrol，所以无法验证ChIP是
否work。否则做个ChIP-PCR就知道是否得到了有效的DNA。
在整个genome里面做TF的binding site也是我们的目标，能找到感兴趣的基因当然最好。
如果直接做deep sequencing的话，时间和费用是个问题。
我们就是因为没有可靠的binding site作为positive constrol，所以无法验证ChIP是
否work。否则做个ChIP-PCR就知道是否得到了有效的DNA。
在整个genome里面做TF的binding site也是我们的目标，能找到感兴趣的基因当然最好。
如果直接做deep sequencing的话，时间和费用是个问题。
p*d
10 楼
没问题
[在 tennisalways (tennisforever) 的大作中提到：]
:上次父母在美国延期了两次（都获得了延期批准），从13年十月住到15年四月。
:这次打算让父母六月初来，入关会有问题吗？
:谢谢
[在 tennisalways (tennisforever) 的大作中提到：]
:上次父母在美国延期了两次（都获得了延期批准），从13年十月住到15年四月。
:这次打算让父母六月初来，入关会有问题吗？
:谢谢
s*s
11 楼
首先，这个浓度做Nanodrop没啥意义
其次，你练啥positive的control都不知道，怎么定义有效？扔出去做library吧
【在 F*****e 的大作中提到】
: 我们用小鼠组织做某个转录因子的ChIP，最终目标是希望能做ChIP-Seq。现在ChIP的流
: 程做完之后由于DNA浓度太低（0.1-0.2ng/ul by Nanodrop），不知道整个ChIP过程是
: 否成功，是否拿到有效的DNA片段。这个转录因子没有非常确定的target gene，所以也
: 无法设计引物做ChIP-PCR。请问各位，还有什么方法可以确定产物中含有富集的DNA片
: 段？多谢！
其次，你练啥positive的control都不知道，怎么定义有效？扔出去做library吧
【在 F*****e 的大作中提到】
: 我们用小鼠组织做某个转录因子的ChIP，最终目标是希望能做ChIP-Seq。现在ChIP的流
: 程做完之后由于DNA浓度太低（0.1-0.2ng/ul by Nanodrop），不知道整个ChIP过程是
: 否成功，是否拿到有效的DNA片段。这个转录因子没有非常确定的target gene，所以也
: 无法设计引物做ChIP-PCR。请问各位，还有什么方法可以确定产物中含有富集的DNA片
: 段？多谢！
t*s
12 楼
请问你或周围的人有过类似的经验吗？
本来打算让父母6月初来。只要来了就办绿卡。
可是看到下面的文章，有点吓到了。毕竟父母上次在美国住了一年半，有点太长了。虽
然两次都是合法延期。
http://www.mitbbs.com/ym_article/ImmigrationNews/31206197.html
【在 p********d 的大作中提到】
: 没问题
: [在 tennisalways (tennisforever) 的大作中提到：]
: :上次父母在美国延期了两次（都获得了延期批准），从13年十月住到15年四月。
: :这次打算让父母六月初来，入关会有问题吗？
: :谢谢
本来打算让父母6月初来。只要来了就办绿卡。
可是看到下面的文章，有点吓到了。毕竟父母上次在美国住了一年半，有点太长了。虽
然两次都是合法延期。
http://www.mitbbs.com/ym_article/ImmigrationNews/31206197.html
【在 p********d 的大作中提到】
: 没问题
: [在 tennisalways (tennisforever) 的大作中提到：]
: :上次父母在美国延期了两次（都获得了延期批准），从13年十月住到15年四月。
: :这次打算让父母六月初来，入关会有问题吗？
: :谢谢
m*n
13 楼
Then you definitely have to make a library for sequencing...... if you get
decent amount of reads and peaks, you can use the data to calculate the
consensus binding sequence for the TF. >
好。
【在 F*****e 的大作中提到】
: 多谢回复。
: 我们就是因为没有可靠的binding site作为positive constrol，所以无法验证ChIP是
: 否work。否则做个ChIP-PCR就知道是否得到了有效的DNA。
: 在整个genome里面做TF的binding site也是我们的目标，能找到感兴趣的基因当然最好。
: 如果直接做deep sequencing的话，时间和费用是个问题。
decent amount of reads and peaks, you can use the data to calculate the
consensus binding sequence for the TF. >
好。
【在 F*****e 的大作中提到】
: 多谢回复。
: 我们就是因为没有可靠的binding site作为positive constrol，所以无法验证ChIP是
: 否work。否则做个ChIP-PCR就知道是否得到了有效的DNA。
: 在整个genome里面做TF的binding site也是我们的目标，能找到感兴趣的基因当然最好。
: 如果直接做deep sequencing的话，时间和费用是个问题。
f*h
14 楼
间隔一年以上再次入境应该没问题。请问楼主签证时顺利吗？签证管问了延期理由吗？
我父母也延期过，最近也想去签证。
我父母也延期过，最近也想去签证。
d*7
15 楼
Before lib prep., to increase confidence，run 10% elutes on western blot to
check whether the protein is successfully pulled down. However, western blot
cannot guarantee the work of ChIP.
【在 F*****e 的大作中提到】
: 我们用小鼠组织做某个转录因子的ChIP，最终目标是希望能做ChIP-Seq。现在ChIP的流
: 程做完之后由于DNA浓度太低（0.1-0.2ng/ul by Nanodrop），不知道整个ChIP过程是
: 否成功，是否拿到有效的DNA片段。这个转录因子没有非常确定的target gene，所以也
: 无法设计引物做ChIP-PCR。请问各位，还有什么方法可以确定产物中含有富集的DNA片
: 段？多谢！
check whether the protein is successfully pulled down. However, western blot
cannot guarantee the work of ChIP.
【在 F*****e 的大作中提到】
: 我们用小鼠组织做某个转录因子的ChIP，最终目标是希望能做ChIP-Seq。现在ChIP的流
: 程做完之后由于DNA浓度太低（0.1-0.2ng/ul by Nanodrop），不知道整个ChIP过程是
: 否成功，是否拿到有效的DNA片段。这个转录因子没有非常确定的target gene，所以也
: 无法设计引物做ChIP-PCR。请问各位，还有什么方法可以确定产物中含有富集的DNA片
: 段？多谢！
t*s
16 楼
我父母顺利拿到10年签证，没问题。他们前五次来美国，4次延期。上次还延期了两次
，在美国住了一年半。
这次中信银行免面谈签的，没见签证官。
以前有次签证官提醒他们不要再延期了，否则以后不给签了。我们也没太当回事。
这次打算父母来后给他们办绿卡，反而有点紧张，怕不让入关。
真要不让入关，可就惨了。
【在 f*****h 的大作中提到】
: 间隔一年以上再次入境应该没问题。请问楼主签证时顺利吗？签证管问了延期理由吗？
: 我父母也延期过，最近也想去签证。
，在美国住了一年半。
这次中信银行免面谈签的，没见签证官。
以前有次签证官提醒他们不要再延期了，否则以后不给签了。我们也没太当回事。
这次打算父母来后给他们办绿卡，反而有点紧张，怕不让入关。
真要不让入关，可就惨了。
【在 f*****h 的大作中提到】
: 间隔一年以上再次入境应该没问题。请问楼主签证时顺利吗？签证管问了延期理由吗？
: 我父母也延期过，最近也想去签证。
y*1
17 楼
If you can't find any known target of your transcription factor(TF) in the
literature, you can test if that TF binds its own promoter. In our
experience, a TF will bind to its own promoter, most of the time.
literature, you can test if that TF binds its own promoter. In our
experience, a TF will bind to its own promoter, most of the time.
d*g
18 楼
竟然可以延期两次，有什么好的理由吗？
这次一定要谨慎，最好间隔一年再入关。
【在 t**********s 的大作中提到】
: 我父母顺利拿到10年签证，没问题。他们前五次来美国，4次延期。上次还延期了两次
: ，在美国住了一年半。
: 这次中信银行免面谈签的，没见签证官。
: 以前有次签证官提醒他们不要再延期了，否则以后不给签了。我们也没太当回事。
: 这次打算父母来后给他们办绿卡，反而有点紧张，怕不让入关。
: 真要不让入关，可就惨了。
这次一定要谨慎，最好间隔一年再入关。
【在 t**********s 的大作中提到】
: 我父母顺利拿到10年签证，没问题。他们前五次来美国，4次延期。上次还延期了两次
: ，在美国住了一年半。
: 这次中信银行免面谈签的，没见签证官。
: 以前有次签证官提醒他们不要再延期了，否则以后不给签了。我们也没太当回事。
: 这次打算父母来后给他们办绿卡，反而有点紧张，怕不让入关。
: 真要不让入关，可就惨了。
F*e
19 楼
多谢各位！
看来需要直接做deep sequencing才能知道了，这种情况下需要把input也同样
sequencing么？这个应该就是打碎以后的genomic DNA吧。另外，sequencing的结果是
否要和input结果比较后才能知道有没有enriched DNA fragment？
看来需要直接做deep sequencing才能知道了，这种情况下需要把input也同样
sequencing么？这个应该就是打碎以后的genomic DNA吧。另外，sequencing的结果是
否要和input结果比较后才能知道有没有enriched DNA fragment？
b*n
20 楼
mark, mark -
林先生表示，海关工作人员计算访客在美停留日期并不是按照历年(Calender Year)来
算，而是按照年度周期，即从访客入境美国当天起向前推一年，如果访客在这一年中在
美停留时间超过六个月，再次入境时就有“逾期居留”的问题，被海关盘问甚至被送往
“小黑屋”、遣返的机率很大。
Is that true?
林先生表示，海关工作人员计算访客在美停留日期并不是按照历年(Calender Year)来
算，而是按照年度周期，即从访客入境美国当天起向前推一年，如果访客在这一年中在
美停留时间超过六个月，再次入境时就有“逾期居留”的问题，被海关盘问甚至被送往
“小黑屋”、遣返的机率很大。
Is that true?
m*n
21 楼
OF COURSE you need to sequence input DNA... did you read my previous
comments..
You really need to talk to the sequencing facility people first before you
make you next move. Also after preping your library, you have to do a
quality control analysis before moving to deep-sequencing.
【在 F*****e 的大作中提到】
: 多谢各位！
: 看来需要直接做deep sequencing才能知道了，这种情况下需要把input也同样
: sequencing么？这个应该就是打碎以后的genomic DNA吧。另外，sequencing的结果是
: 否要和input结果比较后才能知道有没有enriched DNA fragment？
comments..
You really need to talk to the sequencing facility people first before you
make you next move. Also after preping your library, you have to do a
quality control analysis before moving to deep-sequencing.
【在 F*****e 的大作中提到】
: 多谢各位！
: 看来需要直接做deep sequencing才能知道了，这种情况下需要把input也同样
: sequencing么？这个应该就是打碎以后的genomic DNA吧。另外，sequencing的结果是
: 否要和input结果比较后才能知道有没有enriched DNA fragment？
F*e
22 楼
多谢momoshuihan。
我们是ChIP新手，希望大牛们指导。问题是：
1.input DNA
2.IgG-ChIPed DNA
3.Sample anitbody-ChIPed DNA
这三种样品是否都需要做sequencing？DNA是否得到enrichment是和1比较还是2比较？
另外能介绍一下怎样做qulity control analysis么？多谢！！
【在 m*********n 的大作中提到】
: OF COURSE you need to sequence input DNA... did you read my previous
: comments..
: You really need to talk to the sequencing facility people first before you
: make you next move. Also after preping your library, you have to do a
: quality control analysis before moving to deep-sequencing.
我们是ChIP新手，希望大牛们指导。问题是：
1.input DNA
2.IgG-ChIPed DNA
3.Sample anitbody-ChIPed DNA
这三种样品是否都需要做sequencing？DNA是否得到enrichment是和1比较还是2比较？
另外能介绍一下怎样做qulity control analysis么？多谢！！
【在 m*********n 的大作中提到】
: OF COURSE you need to sequence input DNA... did you read my previous
: comments..
: You really need to talk to the sequencing facility people first before you
: make you next move. Also after preping your library, you have to do a
: quality control analysis before moving to deep-sequencing.
w*l
23 楼
We also did RNA polymerase II pull down as a positive control.
m*n
24 楼
You can just use input DNA and Antibody-ChIPed DNA for sequencing. For
quality control, your sequencing core facility will run the test for you, e.
g. Bio-analyzer chip etc.
One thing just hit me... at least in our hand, the DNA fragments needs to be
smaller for sequencing than for qPCR... I assume that you checked your
sonication efficiency and know the size of your smears before you did ChIP..
. Again, the best way is to talk to your sequencing facility and ask them
for technical details. This is rather important and will be more informative
than our advice here, because every facility might run samples differently.
Your facility core may even prep the library for you, if you did not have
any experience before. After the library is preped, they can run the
bioanalyzer first to check the size of your samples, the concentration as
well as the DNA integrity/purity etc etc...
PoII-ChIP is usually used as an indication that you can really do ChIP
experiments with these samples (to exclude the possibility of bad protocol,
bad protein protection etc.). But if you have obtained a resonable amount of
DNA (considering your starting cells/tissue), it should be fine.
【在 F*****e 的大作中提到】
: 多谢momoshuihan。
: 我们是ChIP新手，希望大牛们指导。问题是：
: 1.input DNA
: 2.IgG-ChIPed DNA
: 3.Sample anitbody-ChIPed DNA
: 这三种样品是否都需要做sequencing？DNA是否得到enrichment是和1比较还是2比较？
: 另外能介绍一下怎样做qulity control analysis么？多谢！！
quality control, your sequencing core facility will run the test for you, e.
g. Bio-analyzer chip etc.
One thing just hit me... at least in our hand, the DNA fragments needs to be
smaller for sequencing than for qPCR... I assume that you checked your
sonication efficiency and know the size of your smears before you did ChIP..
. Again, the best way is to talk to your sequencing facility and ask them
for technical details. This is rather important and will be more informative
than our advice here, because every facility might run samples differently.
Your facility core may even prep the library for you, if you did not have
any experience before. After the library is preped, they can run the
bioanalyzer first to check the size of your samples, the concentration as
well as the DNA integrity/purity etc etc...
PoII-ChIP is usually used as an indication that you can really do ChIP
experiments with these samples (to exclude the possibility of bad protocol,
bad protein protection etc.). But if you have obtained a resonable amount of
DNA (considering your starting cells/tissue), it should be fine.
【在 F*****e 的大作中提到】
: 多谢momoshuihan。
: 我们是ChIP新手，希望大牛们指导。问题是：
: 1.input DNA
: 2.IgG-ChIPed DNA
: 3.Sample anitbody-ChIPed DNA
: 这三种样品是否都需要做sequencing？DNA是否得到enrichment是和1比较还是2比较？
: 另外能介绍一下怎样做qulity control analysis么？多谢！！
w*i
25 楼
ChIP 完了，我们用Qubit 2.0 Fluorometer来测浓度。然后用10ng的DNA 做prep，然后
ChIP-Seq. 不能用nanodrop测，确实没有意义，测不准
ChIP-Seq. 不能用nanodrop测，确实没有意义，测不准
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