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急急：求教一个关于蛋白结合的问题

急急：求教一个关于蛋白结合的问题# Biology - 生物学

D*a2011-11-11 08:11

1 楼

前一阵申请教职未果。由于要解决身份（J1快到期），老板找的人脉，在研究所求得
staff一职位。对方只给了口头应允，还没签。老板说：你先答应下来，其他学校面试
还照样去。于是我就口头答应对方去。现在有别的学校faculty职位催推荐信；是一个
很早就申请了的职位。老板却不肯发，还问我为什么还在申请别的职位。
我老板是担心自己和对方的关系受损？可我连offer letter都还没收到呢。
求剖析一下老板咋想的？我要不要态度明确的催他发信？

z*e2011-11-11 08:11

2 楼

这么简单的剧情

W*g2011-11-11 08:11

3 楼

http://promotions.newegg.com/NEemail/Nov-0-2011/72HSale11/index

l*g2011-11-11 08:11

4 楼

如果蛋白A和蛋白B结合，用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体
外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性，但是如果用A-His6就检测
不到B-His6酶活性的上升，所以我的问题是，A-His6和B-His6也能结合吗，会不会由于
His6带有正电，两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。

m*n2011-11-11 08:11

5 楼

你老板不是让你先答应下来，其他学校面试还照样去的么?

【在 D***a 的大作中提到】

: 前一阵申请教职未果。由于要解决身份（J1快到期），老板找的人脉，在研究所求得
: staff一职位。对方只给了口头应允，还没签。老板说：你先答应下来，其他学校面试
: 还照样去。于是我就口头答应对方去。现在有别的学校faculty职位催推荐信；是一个
: 很早就申请了的职位。老板却不肯发，还问我为什么还在申请别的职位。
: 我老板是担心自己和对方的关系受损？可我连offer letter都还没收到呢。
: 求剖析一下老板咋想的？我要不要态度明确的催他发信？

t*m2011-11-11 08:11

6 楼

his-tag的A有表达吗?

【在 l***g 的大作中提到】

: 如果蛋白A和蛋白B结合，用GST-A和B-His6进行GST-pulldown可以得到很好的结果。体
: 外酶活性实验发现GST-A也可以很好的促进B-His6的酶活性，但是如果用A-His6就检测
: 不到B-His6酶活性的上升，所以我的问题是，A-His6和B-His6也能结合吗，会不会由于
: His6带有正电，两个His6-tag的protein之间相互排斥没有结合。

D*a2011-11-11 08:11

7 楼

是的。所以我不理解。他说这话时，对方还没给口头offer。现在是对方给了口头的，
我也口头答应去。
他当时说那样的话是不是就是想安抚我答应了？我不明白，如果他觉得那个要推荐信的
地方我没戏，发了也不大可能改变现在的结果，要是他觉得我很有希望，我拿到
faculty对他来说也比较好吧。怎么都说不通为啥不给我发。我都写了两封email解释这
个是我得到他引荐的地方的信儿之前申的，而且这个学校的deadline早过了。后来我老
板就不理我了。
有必要吗他？推荐信现成的，花个几分钟upload就得了。

【在 m**n 的大作中提到】

: 你老板不是让你先答应下来，其他学校面试还照样去的么?

l*g2011-11-11 08:11

8 楼

表达很好，表达量比GST tag的A还多。

【在 t**m 的大作中提到】

: his-tag的A有表达吗?

f*e2011-11-11 08:11

9 楼

他可能觉得你已经口头答应了offer,就不应该再考虑别的，和什么时候申请的没关系。

【在 D***a 的大作中提到】

: 是的。所以我不理解。他说这话时，对方还没给口头offer。现在是对方给了口头的，
: 我也口头答应去。
: 他当时说那样的话是不是就是想安抚我答应了？我不明白，如果他觉得那个要推荐信的
: 地方我没戏，发了也不大可能改变现在的结果，要是他觉得我很有希望，我拿到
: faculty对他来说也比较好吧。怎么都说不通为啥不给我发。我都写了两封email解释这
: 个是我得到他引荐的地方的信儿之前申的，而且这个学校的deadline早过了。后来我老
: 板就不理我了。
: 有必要吗他？推荐信现成的，花个几分钟upload就得了。

e*s2011-11-11 08:11

10 楼

为什么要纠缠另一个tag呢？你这个Tag换了，N,C融合位点也换了！
要担心Tag的影响，把GST切了，看对B的活性是否有促进不是更有说服力？

【在 l***g 的大作中提到】

D*a2011-11-11 08:11

11 楼

他说的让我先答应的。不知道是忽悠我，还是他改变主意了。

【在 f*******e 的大作中提到】

: 他可能觉得你已经口头答应了offer,就不应该再考虑别的，和什么时候申请的没关系。

l*g2011-11-11 08:11

12 楼

也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
这一个了

【在 e****s 的大作中提到】

: 为什么要纠缠另一个tag呢？你这个Tag换了，N,C融合位点也换了！
: 要担心Tag的影响，把GST切了，看对B的活性是否有促进不是更有说服力？

r*e2011-11-11 08:11

13 楼

我不负责任的猜测：
"老板说：你先答应下来，其他学校面试还照样去。" 潜台词，让你赶紧签字，好专心
把手头的事情做了。
“老板却不肯发，还问我为什么还在申请别的职位。” 潜台词，让你专心把手头的事
情做了。

W*e2011-11-11 08:11

14 楼

GST可以二聚, 有可能是二聚促进了pulldown和酶活. :)
但是没理由6p3载体表达出来的比5的少, 还降解

也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
这一个了

【在 l***g 的大作中提到】

: 也试过切gst，但是切后纯化，再去掉factor xa，所得到的蛋白实在太少了，想用
: precision来切只要一步就能纯化加去掉蛋白酶，用pGEX6p-3载体做的gst蛋白表达量又
: 比pGEX5的少了好几倍，还降解的很厉害。我也觉得不用再考虑别的tag了，别的文献上
: 都是用GST tag的蛋白来做我的这个in vitro GTPase assay的，但是合作的实验室就非
: 要去掉tag，或者用his的，就为这点事情耽误了快2个月了，急死我了，实验就差最后
: 这一个了

D*a2011-11-11 08:11

15 楼

嗯。他给我发了，我就不花功夫在这问了。

【在 r******e 的大作中提到】

: 我不负责任的猜测：
: "老板说：你先答应下来，其他学校面试还照样去。" 潜台词，让你赶紧签字，好专心
: 把手头的事情做了。
: “老板却不肯发，还问我为什么还在申请别的职位。” 潜台词，让你专心把手头的事
: 情做了。