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急,请教lentivirus shRNA技术问题
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急,请教lentivirus shRNA技术问题# Biology - 生物学
d*g
1
DQ,请你收起那只言片语。
本来已经戒网好久了,最近也真的特忙,不是你的信,我不会上mit,或者最起码不会login,更不会像这两天一样上来打打趣灌灌水,也就根本不会收到你那些酸酸涩涩的只言片语。
是的,这封信写给你,提醒你,既然答应了别的人要好好仔细经营每一天,现在又何必时不时往我这里发来只言片语。请你尊重现在身边的人,实现你现在给人的承诺。与你一起的岁月就像去年秋天的落叶,红了,黄了,落了,就化了。现在是春天了,别再揪着那些不存在了的哀怨吧。
不知道你还要否认什么。否认了我的所有,才能够证明你现在正确的选择?
不知道你努力诉说自己现在的幸福为了什么。只是我每次看到了都觉得心里又为你缩了缩,因为你自己说过,幸福不能说,因为幸福一说就破。
谢谢你送我的2010的寒冬,拜你的所赐,让我2011才有机会彻底复活。
我还说过,我真爱的人就那么一个,因为天时地利,因为所有的巧合。是的,我到现在仍然还这么认为。只是这个我爱的人已经死掉了,那么我就更要好好地过。
请收起你那只言片语吧,如果真的有那么一天要再相遇,如果真的有那么一天会世界末日,或许我还会记得,或许我还会多份你仅存的馒头一个半个。仅此而已,仅此而已了。
祝好,保重!
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G*W
2
在西班牙出生,被達賴喇嘛認定是活佛轉世的靈童,長大後卻寧願還俗當個凡夫俗子,
這是怎麼回事?
..西班牙一個從小就被認定是轉世活佛的男子,在印度寺廟中長大成人,到了18歲,他
決定回到原生家庭,他發現,還是在出生的地方,活得比較自在。
(歐賽爾)生在西班牙南部的(格拉那達),是家裡的第五個孩子,他的母親(瑪利亞
)是佛教徒,皈依在(圖敦耶喜)喇嘛門下,耶喜喇嘛1970年代到過西方,他和一般的
喇嘛很不一樣,他熱愛西方文化,還去過迪士尼樂園,圖敦耶喜喇嘛1984年、49歲時,
在洛杉磯去世,幾個月後,瑪利亞懷孕了,(歐賽爾)還是小嬰兒的時候,就顯現出一
些不同於常人的特質,後來他被帶去達蘭沙拉測試,經達賴喇嘛認定,成為活佛,兩歲
坐床,從此和家人分離,不過他甘之如飴,這樣的日子過了幾年,九歲時,他突然想要
回家,於是他的父親帶著他弟弟,去廟裡陪他,少年時期,他讀了(赫曼赫賽)的(流
浪者之歌),開始懷疑自己到底是不是佛教徒,15、6歲時,脫離宗教的意念,變得異
常強烈,兩年多後他終於下定決心,現在,他回到了西班牙,靠教人藏語,貼補生活,
沒有正職,目前正在拍攝一部與藏傳佛教有關的紀錄片。他的母親依然相信,兒子是活
佛轉世,至於他自己,則不是那麼確定。
..
作家施寄青女士為此也寫了以下一篇專欄,她的說法,有知識的專家們,您認為如何?
合乎道理嗎?
『1986年,年僅14個月大的歐賽.托里斯因被達賴喇嘛認證為耶喜喇嘛轉世的靈童,吸
引媒體注意。明眼人一看這是政治操作,如果西方也有靈童轉世,有助藏傳佛教的推廣
,一如美國職棒大聯盟找日本、台灣等亞洲國家的球員加入,著眼亞洲商機,而非倡導
種族平等。
只是靈童長大後不吃這套而還俗,還大吐苦水,說他感覺像活在謊言中。他在18歲離開
寺院前,沒看過電視,踢過足球,遑論與異性交往。他父母要負很大的責任,只因他們
的信仰或愚昧或虛榮心作祟,葬送孩子正常的童年。
台灣最近有團體出面揭發許多來台弘法的喇嘛、仁波切如何招搖撞騙,住高級飯店,以
傳法、灌頂、男女雙修,騙了不少信眾。其中包括寫《西藏生死書》的作者索甲仁波切
以及有名的梵唱者貝瑪堪仁波切,還有所謂的時尚活佛盛噶仁波切。他們果真是「酒肉
穿腸過,佛祖心中坐」的奉行者。』
===
而達賴喇嘛,他有什麼資格去認定活佛 ?
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S*s
3
40GB,三星,ddr3 1333
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b*8
4
最近开始自己包装慢病毒shRNA,用的是之前组里师姐的protocol,基本上是基于TRONO
LAB的protocol。之前师姐包装的病毒,效率很高,基本上能KD八成到九成。最近我自
己包装了两次,浓缩后根据之前师姐包装的病毒用量感染肝癌细胞,细胞生长速度明显
延缓,形态改变也跟之前的相似。但是做western却只能看到很marginal的蛋白水平降
低,在有的细胞株甚至完全看不到KD。我用GFP质粒转染HEK293FT,效率很高,24小时
至少看到90%的细胞有GFP表达,然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞,24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP,说明包装过程中所用的包装质粒,试剂以及细胞应该没
有问题。我现在有两个疑问,请有经验的战友指点:
1)师姐留给我的protocol上,转染HEK293FT的方法如下,以10cmdish为例:
prepare the following transfection mix:
10.0 ug GFP(or other gene of interest)
10.5 ug pLP1
10.5 ug pLP2
9.0 ug pVSVG.
Then add in this order:
293.3 ul of TE buffer (0.1×, pH 8.8)
155.6 ul d.d.water
50.2 ul CaCl2 (2.5M)
Briefly mix, then add 500 ul 2×HBSS, dropwise under agitation by vortexing
at least 1~2min.
Wait at least 5min(no more than 30min) at RT.
我看到别的常用的protocol,都是加齐各种质粒后直接用双蒸水补齐到500ul,然后再
加等体积的HBSS,最后加一定量的CaCl2。不知道我们这个protocol里加0.1×, pH 8.8
的TE用意何在?
2)在转染后36和60小时收集病毒上清,3000 × g for 15 minutes at 4℃ to remove
cells and cell debris. 然后用PEG-it Virus Precipitation Solution在4度沉淀至
少12小时,1500 × g for 30
minutes at 4ºC离心后用PBS重悬病毒颗粒,分装保存与-70度。每次用浓缩后的
病毒感染肝癌细胞后,都能在medium里面看到很多黑色的小点点(师姐包装的病毒也有
,但没这么明显),又不是污染,不同的细胞株里这个小黑点的多寡不一,有的很多很
多。很纳闷这个黑点到底来源于什么?磷酸钙沉淀?239FT细胞碎片?KD效率低是不是
因为这些小黑点的原因?
切盼高手指教,更期望分享各种成功的技巧和经验。
不甚感谢
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w*e
5
哈哈哈.
算了, 就只破这一次例, 再去找她吃一次饭又何妨?
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G*W
6
【而十四 世 達賴喇嘛亦由密宗諸師奉為觀音菩薩之化身。雖自稱為平凡人,然有時
則又認同之,今時台灣之密宗所印行書籍中,尚可 見彼如是前後自相矛盾之言也。此
類夤緣諸佛菩薩,而冒稱諸佛菩薩化身以邀恭敬供養者,即是密宗推廣手段之一也。然
而觀世音菩薩乃正法明如來 倒駕慈航、以利眾生者也;以如來之智慧,以現 前示現等
覺 菩薩之智慧,焉有可能「化身為達賴之後,卻墮常見法及 斷見法中」? 焉有可能
信受應成派中觀之無因論 ?焉有可能化生為達賴之後卻來否定自己於《心經》中所說
「不生不滅之真相識」? 有智之人,稍加思維觀察即可分辨真假, 無智之人唯有盲從
信受之爾 。】
再者, 我們應當如是思 惟 :哪一個輪迴於六道的眾生不是一世又一世的轉世?每個
人都是生生世世在六道中轉世, 故藏密轉世之說無稀奇處,只是荒唐一場的戲論 ,期
望學子勿被藏密假造轉世之說欺矇 ,當以智慧簡擇,當以親證二乘的解脫及大乘成佛
之道的不可思議解脫為宗,勿迷信於此假造轉世之說。
而藏密的轉生再來之說,在歷代達賴喇嘛暗中殺害異己,並在他們確實否定正法、 淫
人妻女 、師徒亂倫的大惡業下 ,當然還是會轉世再來的,只是轉世再來時不是身在人
道中,而是在三惡道中 ,這是依正理及聖教的正思惟,就可以輕易確定的事實;而眾
生普被誤導,追隨他們同造邪淫及 破法的大惡業,誠可憐憫, 大家應正思維, 使得那
些受藏密謊言籠罩的眾生能回歸正見、遠離惡業。

【在 G**W 的大作中提到】
: 在西班牙出生,被達賴喇嘛認定是活佛轉世的靈童,長大後卻寧願還俗當個凡夫俗子,
: 這是怎麼回事?
: ..西班牙一個從小就被認定是轉世活佛的男子,在印度寺廟中長大成人,到了18歲,他
: 決定回到原生家庭,他發現,還是在出生的地方,活得比較自在。
: (歐賽爾)生在西班牙南部的(格拉那達),是家裡的第五個孩子,他的母親(瑪利亞
: )是佛教徒,皈依在(圖敦耶喜)喇嘛門下,耶喜喇嘛1970年代到過西方,他和一般的
: 喇嘛很不一樣,他熱愛西方文化,還去過迪士尼樂園,圖敦耶喜喇嘛1984年、49歲時,
: 在洛杉磯去世,幾個月後,瑪利亞懷孕了,(歐賽爾)還是小嬰兒的時候,就顯現出一
: 些不同於常人的特質,後來他被帶去達蘭沙拉測試,經達賴喇嘛認定,成為活佛,兩歲
: 坐床,從此和家人分離,不過他甘之如飴,這樣的日子過了幾年,九歲時,他突然想要

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g*5
7
为什么要钙转?效率低。
换mirus Transit LT1。
openbiosystem 有protocol
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M*9
8
你这是帮人, 还是害人啊。 那个都承诺别人了。。。

【在 w********e 的大作中提到】
: 哈哈哈.
: 算了, 就只破这一次例, 再去找她吃一次饭又何妨?

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b*8
9
谢谢楼上,终于等到回复了
鉴于我帖子中描述的这个protocol已经是我师姐建立的很成熟的方法,不过在我这里遇
到了一些问题,所以我更期待针对这些问题的意见和建议,目前暂不考虑更换protocol
,谢谢啦
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w*e
10
看那边进展的情况了, 一般不断给EX发这种信息的,应该也就是个拉拉手的阶段吧.

【在 M*********9 的大作中提到】
: 你这是帮人, 还是害人啊。 那个都承诺别人了。。。
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q*g
11
你的shRNA和你师姐的完全一样吗?
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M*9
12
什么阶段重要么? LZ又不是垃圾桶。 不要了踢开, 有用了再骚扰一下。

【在 w********e 的大作中提到】
: 看那边进展的情况了, 一般不断给EX发这种信息的,应该也就是个拉拉手的阶段吧.
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b*8
13

是一样的,我们一直使用的sigma 的 PLKO.1-puro-shRNA 质粒,我现在每次都是从师
姐留给我的那管质粒中取一点出来做转化然后midiprep。

【在 q******g 的大作中提到】
: 你的shRNA和你师姐的完全一样吗?
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w*e
14
小女生,脾气怪点儿, 正常.

【在 M*********9 的大作中提到】
: 什么阶段重要么? LZ又不是垃圾桶。 不要了踢开, 有用了再骚扰一下。
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d*p
15
然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞,24小时候也
能看到至少80%的细胞表达GFP,说明包装过程中所用的包装质粒,试剂以及细胞应该没
有问题。
48-72小时候再看是否有GFP。GFP Debries, 会附在细胞上,看起来阳性,实际不是。
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M*9
16
要自己乐意当垃圾桶, 那今后点儿背就不能怨社会了。

【在 w********e 的大作中提到】
: 小女生,脾气怪点儿, 正常.
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b*8
17
好的,下次我再试试看

【在 d*p 的大作中提到】
: 然后我收集这些上清直接去感染肝癌细胞,24小时候也
: 能看到至少80%的细胞表达GFP,说明包装过程中所用的包装质粒,试剂以及细胞应该没
: 有问题。
: 48-72小时候再看是否有GFP。GFP Debries, 会附在细胞上,看起来阳性,实际不是。

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w*e
18
嗯,说的也有道理.
可谁没有年轻犯错误的阶段呢?

【在 M*********9 的大作中提到】
: 要自己乐意当垃圾桶, 那今后点儿背就不能怨社会了。
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r*e
19
先试探试探
对方爱你,你再爱她

【在 w********e 的大作中提到】
: 嗯,说的也有道理.
: 可谁没有年轻犯错误的阶段呢?

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w*e
20
咋试?
是你先主动? 还是先假装被吸引?

【在 r***e 的大作中提到】
: 先试探试探
: 对方爱你,你再爱她

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r*e
21
对方对你有没有好感还是能感觉出来的吧
除非是超级迟钝的郭靖

【在 w********e 的大作中提到】
: 咋试?
: 是你先主动? 还是先假装被吸引?

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w*e
22
感觉这东西靠不住, 真的靠不住!!!

【在 r***e 的大作中提到】
: 对方对你有没有好感还是能感觉出来的吧
: 除非是超级迟钝的郭靖

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