问个免疫沉淀Immunoprecipitation的问题。 - 未名空间MITBBS历史存档

问个免疫沉淀Immunoprecipitation的问题。# Biology - 生物学

S*s2012-02-02 08:02

1 楼

给个科普的链接：http://www.radon.com/radon/radon_levels.html
粗略总结一下：
氡气是一种放射性气体，会致肺癌，氡气含量每增加2.7pCi/L，肺癌得的概率会增加
16%。
全美室外平均氡气含量是0.4pCi/L,有的可以达到0.75pCi/L.
全美2/3多的房子室内氡气一般超过0.4pCi/L,所以EPA制定一个可以接受的室内氡气含
量标准，就是4pCi/L.
但是这个4pCi/L并不说明这个指数一下就是安全的。那你能接受多大指数的氡气含量呢
？想想我们平常的生活和饮食习惯本身就有很多不安全/健康的因素，比方说抽烟，吃
咸菜，吃松花蛋，开车，吸汽车尾气。自己给自己拿决定了。
再说一遍那个松花蛋，含铅是出名的，所以就有了无铅松花蛋一说，可是所谓的无铅，
只是含铅量低于了一定的标准。
还有那个抽烟有害...

y*g2012-02-02 08:02

2 楼

大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
大家有protocol可以share一下吗？
我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
很崩溃~~
求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~

g*22012-02-02 08:02

3 楼

人类一思考，上帝就发笑。

【在 S**********s 的大作中提到】

: 给个科普的链接：http://www.radon.com/radon/radon_levels.html
: 粗略总结一下：
: 氡气是一种放射性气体，会致肺癌，氡气含量每增加2.7pCi/L，肺癌得的概率会增加
: 16%。
: 全美室外平均氡气含量是0.4pCi/L,有的可以达到0.75pCi/L.
: 全美2/3多的房子室内氡气一般超过0.4pCi/L,所以EPA制定一个可以接受的室内氡气含
: 量标准，就是4pCi/L.
: 但是这个4pCi/L并不说明这个指数一下就是安全的。那你能接受多大指数的氡气含量呢
: ？想想我们平常的生活和饮食习惯本身就有很多不安全/健康的因素，比方说抽烟，吃
: 咸菜，吃松花蛋，开车，吸汽车尾气。自己给自己拿决定了。

C*h2012-02-02 08:02

4 楼

抗体可能有问题。
先做个western blot再说。

1ug

【在 y********g 的大作中提到】

: 大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
: 大家有protocol可以share一下吗？
: 我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
: 看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
: 几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
: 另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
: 的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
: 很崩溃~~
: 求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~

S*s2012-02-02 08:02

5 楼

你应该没笑，要不就是上帝了

s*a2012-02-02 08:02

6 楼

也许内源表达太低测不到……全细胞裂解液的 positive control 有没有条带？
没的话换用高灵敏度的发光底物试试

1ug

【在 y********g 的大作中提到】

: 大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
: 大家有protocol可以share一下吗？
: 我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
: 看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
: 几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
: 另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
: 的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
: 很崩溃~~
: 求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~

m*y2012-02-02 08:02

7 楼

还是回到辐射这个月经贴上吧　这个喜感差了点

c*r2012-02-02 08:02

8 楼

你的蛋白在胞质还是核啊

A*y2012-02-02 08:02

9 楼

You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
native IP.

s*a2012-02-02 08:02

10 楼

用light-chain specific的二抗可以解决你IgG的背景问题。

1ug

【在 y********g 的大作中提到】

: 大家有做过内源性的IP吗？就是不做转染，不加TAG的那种？
: 大家有protocol可以share一下吗？
: 我做了几次，都是连pull down的蛋白都看不到。
: 看了别人的paper，大部分都是用了tag的。但是老板说，不用tag也能出来bank。做了
: 几个月了，不知道大家有没有什么好的建议？
: 另外，就是IgG的unspecific bands实在是太多了，从20-60Kda都是很强的带，我用1ug
: 的抗体~~~ 我需要的蛋白在65 和 85左右，旁边带很强，看不到target的带。
: 很崩溃~~
: 求大牛指点。伪币答谢吧~~谢谢啦~~~

a*l2012-02-02 08:02

11 楼

why use T-25? T-25 is not very big, so there are not too many cells. why don
't use T-75?

for

【在 A******y 的大作中提到】

: You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
: some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
: antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
: native IP.

y*g2012-02-02 08:02

12 楼

全细胞裂解液有条带，western 也是work了~~ 主要还是2个问题，最主要的一个还是背
景太高。我用抗mouse的pull down，用抗兔的蛋白检测，还是很多的背景杂带~~~
大家beads是怎么clear的？
我看protocol 通常有3种
1）先加Beads到样品中，然后把上清移到另一个管子里，然后再加beads和抗体过夜。
2）先将Beads和裂解液（不是样品）混合，rotate 1h，然后再离心，把preclear的
Beads+抗体+样品液混在一起4度过夜。
3）将抗体和样品4度过夜，然后把Beads加进去，4度转4h左右。
3种方法，哪种背景更少啊，还是说差不多？谢谢大家了

A*y2012-02-02 08:02

13 楼

You can use a T-75. It's easy for me because I have too many conditions and
it works at that amount of cells (I have lymphocyte, too). There are some
pull down require minimum of T75 or larger.

don

【在 a****l 的大作中提到】

: why use T-25? T-25 is not very big, so there are not too many cells. why don
: 't use T-75?
:
: for

c*b2012-02-02 08:02

14 楼

不要用二抗，用protein a-hrp会好些

【在 y********g 的大作中提到】

: 全细胞裂解液有条带，western 也是work了~~ 主要还是2个问题，最主要的一个还是背
: 景太高。我用抗mouse的pull down，用抗兔的蛋白检测，还是很多的背景杂带~~~
: 大家beads是怎么clear的？
: 我看protocol 通常有3种
: 1）先加Beads到样品中，然后把上清移到另一个管子里，然后再加beads和抗体过夜。
: 2）先将Beads和裂解液（不是样品）混合，rotate 1h，然后再离心，把preclear的
: Beads+抗体+样品液混在一起4度过夜。
: 3）将抗体和样品4度过夜，然后把Beads加进去，4度转4h左右。
: 3种方法，哪种背景更少啊，还是说差不多？谢谢大家了

g*r2012-02-02 08:02

15 楼

正解！

for

【在 A******y 的大作中提到】

: You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
: some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
: antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
: native IP.

n*n2012-02-02 08:02

16 楼

there are too many answers to the problem:
1. cell types (find a higher expression cell type or line)
2. antibody quality (antibody are NOT universal, being good for western does
not mean good for IP. if the antibody was never tested for IP, you can try
dilution factor/incubation time. use of transfected lane as control will
help [can you IP your transfected target using both your antibody and anti-
TAG?]. try different antibody from different source)
3. your IP skills (by no means i look down at you。IP sounds easy, but......
I dont need to elaborate).
4. ...... (具体问题具体分析)

i*a2012-02-02 08:02

17 楼

一般就是抗体的问题，或者是buffer的问题。换个抗体试试。

a*l2012-02-02 08:02

18 楼

再请教一个, 100ug 的抗体是不是太多了? 算起来要上百 ul 的抗体....

for

【在 A******y 的大作中提到】

: You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
: some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
: antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
: native IP.

L*e2012-02-02 08:02

19 楼

yep! this is the right way~

for

【在 A******y 的大作中提到】

: You need to cross-link your ab to your beads, magnetic beads work best but
: some antibodies can not handle the cross-link. You also need a lot more
: antibody ~100ug and a lot of cells for native pull-down. I use one T-25 for
: native IP.