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做lentivirus失败，来请教troubleshooting

做lentivirus失败，来请教troubleshooting# Biology - 生物学

C*g2012-03-12 07:03

1 楼

【以下文字转载自 Joke 讨论区】
发信人: splitmind (狗爹猫爸), 信区: Joke
标题: 哈罗，giftzyx，看你的菜这么久了，我也要奔自己的菜了 (转载)
发信站: BBS 未名空间站 (Tue Aug 16 02:00:11 2011, 美东)
发信人: txsky (sunray), 信区: Piebridge
标题: 哈罗，giftzyx，看你的菜这么久了，我也要奔自己的菜了
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Aug 15 21:14:40 2011, 美东)
菜名：八戒踏青
做法：猪肉，带肉骨头，土豆在高压锅煮40分钟；取出在普通锅内翻炒，加入清江小白
菜。
总耗时：1个小时。
disclosure: 盐加多了，有点咸；煮肉时忘记加八角，香料，以及花椒。
分量太大，得管一个星期，不得已炒了2锅，这是其中一锅。

h*y2012-03-12 07:03

2 楼

半夜上来跟大家分享一首歌，大雾版的《北京北京》，词改得很好，唱得也很专业，国
内人才太多了！
大家enjoy！

m*d2012-03-12 07:03

3 楼

之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题

Y*e2012-03-12 07:03

4 楼

还不如转giftzyx 的菜来

l*e2012-03-12 07:03

5 楼

太油菜了。

F*K2012-03-12 07:03

6 楼

follow your old protocol, and do it again.

second
ml
selection

【在 m**********d 的大作中提到】

: 之前做过很多lentivirus，都是超速离心virus之后infect细胞，transduction效率都
: 还不错，这次偷懒没离心，直接用的含有病毒的medium，可是puromycin select一两天
: 后细胞全死光了，以下是详细的protocol:
: vector用的是pBABE-Luc （基于pBABE-puro,只不过也表达luciferase）
: 293T细胞，养在75cm2 flask里，用lipofectamine2000转染的，包装病毒用的是second
: generation packaging system (PAX2,pMD2.G)
: 分别于转染后48hr和72hr collect medium，过了一下0.45uM的filter，又加了8ug/ml
: 的polybrene，就加到要transduce的细胞里去了，24hr之后开始puromycin selection
: 我能想到的问题可能是准备transduce的细胞有点太confluent了，但这也没法解释全死
: 光的结果，我想很可能是没有病毒包装，高人们帮忙看看这过程中可能是么出了问题

B*n2012-03-12 07:03

7 楼

妈呀，这灶台。。。浑身鸡皮疙瘩外加发抖。。。
我都密集恐惧症了

z*n2012-03-12 07:03

8 楼

厉害，唱得很专业，视频也超棒，太有才了！谢推荐。
MM久违了，经常来乐版玩哈，呵呵。。。

G*72012-03-12 07:03

9 楼

puromycin加太早了，感染2-3天后再筛选

second
ml
selection

【在 m**********d 的大作中提到】

g*u2012-03-12 07:03

10 楼

我的天，看见这个灶台什么胃口都没啦。

【在 C********g 的大作中提到】

: 【以下文字转载自 Joke 讨论区】
: 发信人: splitmind (狗爹猫爸), 信区: Joke
: 标题: 哈罗，giftzyx，看你的菜这么久了，我也要奔自己的菜了 (转载)
: 发信站: BBS 未名空间站 (Tue Aug 16 02:00:11 2011, 美东)
: 发信人: txsky (sunray), 信区: Piebridge
: 标题: 哈罗，giftzyx，看你的菜这么久了，我也要奔自己的菜了
: 发信站: BBS 未名空间站 (Mon Aug 15 21:14:40 2011, 美东)
: 菜名：八戒踏青
: 做法：猪肉，带肉骨头，土豆在高压锅煮40分钟；取出在普通锅内翻炒，加入清江小白
: 菜。

z*g2012-03-12 07:03

11 楼

其实现在国内不光是北京这样，这几年在国内呆过的几个北方城市都是这样的！
得肺癌的越来越多，只怕有一天子孙后代都没有可以呼吸的空气了，悲哀啊！

m*u2012-03-12 07:03

12 楼

看infect啥细胞了。跟cell cycle有很大关系。肿瘤细胞很快，原代就慢。记得用GFP infect原代骨髓细胞，4,5天镜下才能看出绿来

second
ml
selection

【在 m**********d 的大作中提到】

h*y2012-03-12 07:03

13 楼

嗯，会的会的，三哥最近咋样啊?

【在 z******n 的大作中提到】

: 厉害，唱得很专业，视频也超棒，太有才了！谢推荐。
: MM久违了，经常来乐版玩哈，呵呵。。。

C*S2012-03-12 07:03

14 楼

pBABE是Retroviral的

second
ml
selection

【在 m**********d 的大作中提到】

z*n2012-03-12 07:03

15 楼

很好，还一直在唱，就是听歌的越来越少了，哈哈。。。

【在 h********y 的大作中提到】

: 嗯，会的会的，三哥最近咋样啊?

m*d2012-03-12 07:03

16 楼

可lentivirus不也是retrovirus么

【在 C**S 的大作中提到】

: pBABE是Retroviral的
:
: second
: ml
: selection

h*y2012-03-12 07:03

17 楼

版上的文章上几次首页应该人气就会上来一些，三哥组织大纽约地区的K歌吧

【在 z******n 的大作中提到】

: 很好，还一直在唱，就是听歌的越来越少了，哈哈。。。

s*y2012-03-12 07:03

18 楼

我也正觉得奇怪呢。
Lenti 和retro是不一样的，lentivirus 即使在细胞不分裂的时候也能感染细胞，
retrovirus 就必须细胞分裂的时候才能成功感染，所以假如target cell 进入
confluent status 发生contact inhibition 之后就会导致效率大大下降

【在 C**S 的大作中提到】

: pBABE是Retroviral的
:
: second
: ml
: selection

z*n2012-03-12 07:03

19 楼

开了春暖和点了再说吧。。。

【在 h********y 的大作中提到】

: 版上的文章上几次首页应该人气就会上来一些，三哥组织大纽约地区的K歌吧

s*d2012-03-12 07:03

20 楼

直接用上清，细胞毒性很大

H*r2012-03-12 07:03

21 楼

我给你加段词：
沁园春- 雾
北京风光，千里朦胧，万里尘飘，
望三环内外，浓雾莽莽，鸟巢上下，阴霾滔滔！
车舞长蛇，烟锁跑道，欲上六环把车飙，需晴日, 将车身内外尽洗扫。
空气如此糟糕，引无数美女戴口罩,惜白化妆了！
唯露双眼，难判风骚。
一代天骄，央视裤衩，只见后座不见腰。
有不要命者，还做早操。

【在 h********y 的大作中提到】

: 半夜上来跟大家分享一首歌，大雾版的《北京北京》，词改得很好，唱得也很专业，国
: 内人才太多了！
: 大家enjoy！