Lenti virus 不整合？ - 未名空间MITBBS历史存档

D*S2012-08-22 07:08

1 楼

最近都不常来美食版了,这一来,香气扑鼻啊!
给大家拜个年,再在这里凑个热闹,发下除夕晚餐的照片.
这里大厨多,班门弄斧了,哈哈.
-----------------------------------
因为人少吗,只有二人,所以就只做了六个菜:四荤二素/四热二凉.饺子是半夜前现做现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.
饮料配了红酒和VOSS矿泉水各一瓶.
最难"伺候"的一道菜是拔丝红薯,除了油炸红薯和糖稀的火候都要合适之外,吃的时机也要合适,必须在刚出锅三分钟左右之内吃完,这样糖还热,就能拔出很长的丝来,时机一过,糖就凉了,如果这时还未吃完,这个菜就变成一砣焦糖粘红薯了.
有人问了:这么油大糖多的菜,吃了得跑步多少分钟才能消耗掉啊?那是,平常哪敢吃啊,就这次做,也只敢做一个红薯的分量,呵呵.
-----------------------------------

l*72012-08-22 07:08

2 楼

要想验证一个男人是不是真的爱你，那么和他睡一次就知道了！我说的睡只是睡觉，不
是发生性关系，现在好多情侣都会进行这种尝试。
谈一个男朋友，不用那么保守，可以大胆和他出去开房，看看和他躺在一张床上，不让
他碰你，他的耐力有多大，当然好多男人肯定会内心波动，因为男人都是用下半身思考
的，他们和女人躺在床上，绝大多数想的都是发生性关系，而女人的定力是很强的，如
果没有男人的挑逗，肯定可以把控的很好。
特别是婚后的男女，长期生活在一起总会有很多的矛盾，如果不及时化解的话，就会产
生婚姻危机。
有一个同事和我说，有一次和婆婆因为带孩子的问题发生了一点冲突，其实也不是什么
大事，但是她自己觉得很委屈，晚上躺在床上本来想和老公唠叨几句，没想到还没等她
开口，老公就说我困了，她坚持着说完这件事情，没想到，老公竟然发起了脾气，说自
己每天上班累的要死，回到家还要处理你们这些鸡毛蒜皮的事情！
她听后很伤心，整夜没有睡觉，但是老公在一旁却打起了呼噜，没过多久，她就发现老
公在外面已经有了别的女人，她很想离婚！
真正爱你的男人，会耐心的听完你说每一句话，但是已经不在乎你的男人，会觉得你说
的每一句话都很烦！

b*n2012-08-22 07:08

3 楼

用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
有看到效果。
Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？

K*t2012-08-22 07:08

4 楼

丰盛！

t*22012-08-22 07:08

5 楼

瞎掰

m*z2012-08-22 07:08

6 楼

被silenced掉了

【在 b*****n 的大作中提到】

: 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
: 达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
: 有看到效果。
: Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
: 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
: 版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？

s*m2012-08-22 07:08

7 楼

拔丝，我的最爱～～～～～

p*h2012-08-22 07:08

8 楼

你说爱一个女人就体贴她，这我信。
你说“认真听完她每一句话”，这纯粹是意淫。这个世界上没人能认真听完你的每一句
话，那么这个世界上没一个人真的爱你。你很可悲。

【在 l****7 的大作中提到】

: 要想验证一个男人是不是真的爱你，那么和他睡一次就知道了！我说的睡只是睡觉，不
: 是发生性关系，现在好多情侣都会进行这种尝试。
: 谈一个男朋友，不用那么保守，可以大胆和他出去开房，看看和他躺在一张床上，不让
: 他碰你，他的耐力有多大，当然好多男人肯定会内心波动，因为男人都是用下半身思考
: 的，他们和女人躺在床上，绝大多数想的都是发生性关系，而女人的定力是很强的，如
: 果没有男人的挑逗，肯定可以把控的很好。
: 特别是婚后的男女，长期生活在一起总会有很多的矛盾，如果不及时化解的话，就会产
: 生婚姻危机。
: 有一个同事和我说，有一次和婆婆因为带孩子的问题发生了一点冲突，其实也不是什么
: 大事，但是她自己觉得很委屈，晚上躺在床上本来想和老公唠叨几句，没想到还没等她

t*t2012-08-22 07:08

9 楼

碰到过
应该是蛋白过表达/敲降有毒
换细胞系/inducible system试试?

b*t2012-08-22 07:08

10 楼

赞呀！

现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.

【在 D**S 的大作中提到】

: 最近都不常来美食版了,这一来,香气扑鼻啊!
: 给大家拜个年,再在这里凑个热闹,发下除夕晚餐的照片.
: 这里大厨多,班门弄斧了,哈哈.
: -----------------------------------
: 因为人少吗,只有二人,所以就只做了六个菜:四荤二素/四热二凉.饺子是半夜前现做现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.
: 饮料配了红酒和VOSS矿泉水各一瓶.
: 最难"伺候"的一道菜是拔丝红薯,除了油炸红薯和糖稀的火候都要合适之外,吃的时机也要合适,必须在刚出锅三分钟左右之内吃完,这样糖还热,就能拔出很长的丝来,时机一过,糖就凉了,如果这时还未吃完,这个菜就变成一砣焦糖粘红薯了.
: 有人问了:这么油大糖多的菜,吃了得跑步多少分钟才能消耗掉啊?那是,平常哪敢吃啊,就这次做,也只敢做一个红薯的分量,呵呵.
: -----------------------------------

b*n2012-08-22 07:08

11 楼

选了三个完全不同的基因，都是同样的现象；而且细胞在感染当代，和control比，生
长和细胞形态没有看出有什么差别；尤其是knock down，预计不会对细胞有这么大的影
响。
感觉毒性不能够很好地解释。Inducible倒是可以试一下。

【在 t****t 的大作中提到】

: 碰到过
: 应该是蛋白过表达/敲降有毒
: 换细胞系/inducible system试试?

b*t2012-08-22 07:08

12 楼

所以叫丝拉么。。。。 //run

【在 s****m 的大作中提到】

: 拔丝，我的最爱～～～～～

h*y2012-08-22 07:08

13 楼

有没有可能第一二代的时候，细胞内还有很多未整合的病毒DNA，这些extrachromosoma
l DNA也能作为模板转录出mRNA，引起高水平的表达（或抑制）。随着细胞分裂，这些未
整合的DNA逐渐丢失，仅剩下整合入染色体的几个copy制造mRNA，表现出来就是整体表达
水平下降。

【在 b*****n 的大作中提到】

: 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
: 达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
: 有看到效果。
: Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
: 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
: 版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？

i*n2012-08-22 07:08

14 楼

菠菜粉丝凉拌菜很给力

r*e2012-08-22 07:08

15 楼

这个基本没可能。
主要是高表达（多拷贝）的细胞没有选择优势。

extrachromosoma
些未
表达

【在 h******y 的大作中提到】

: 有没有可能第一二代的时候，细胞内还有很多未整合的病毒DNA，这些extrachromosoma
: l DNA也能作为模板转录出mRNA，引起高水平的表达（或抑制）。随着细胞分裂，这些未
: 整合的DNA逐渐丢失，仅剩下整合入染色体的几个copy制造mRNA，表现出来就是整体表达
: 水平下降。

D*S2012-08-22 07:08

16 楼

那个菜费力得很啊!

【在 i****n 的大作中提到】

: 菠菜粉丝凉拌菜很给力

h*y2012-08-22 07:08

17 楼

没有选择优势，为什么表达量下降的这么快呢？难道有选择劣势？

【在 r***e 的大作中提到】

: 这个基本没可能。
: 主要是高表达（多拷贝）的细胞没有选择优势。
:
: extrachromosoma
: 些未
: 表达

R*t2012-08-22 07:08

18 楼

菠菜粉丝凉拌菜如何制作？

m*z2012-08-22 07:08

19 楼

先做个quantitative PCR看看copy number有没有下降吧
有下降说明表达该基因可能有生长劣势
没变化就很有可能是被silenced掉了
lz转的什么细胞？

【在 b*****n 的大作中提到】

: 选了三个完全不同的基因，都是同样的现象；而且细胞在感染当代，和control比，生
: 长和细胞形态没有看出有什么差别；尤其是knock down，预计不会对细胞有这么大的影
: 响。
: 感觉毒性不能够很好地解释。Inducible倒是可以试一下。

A*12012-08-22 07:08

20 楼

馋。。。

s*s2012-08-22 07:08

21 楼

啥promoter啊？
报导说cmv在es里面被silence, 我的经验是就算不在es里面，cmv也经常
被干掉了。

【在 b*****n 的大作中提到】

: 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
: 达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
: 有看到效果。
: Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
: 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
: 版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？

x*82012-08-22 07:08

22 楼

口水ing

b*n2012-08-22 07:08

23 楼

就是CMV promoter

【在 s******s 的大作中提到】

: 啥promoter啊？
: 报导说cmv在es里面被silence, 我的经验是就算不在es里面，cmv也经常
: 被干掉了。

c*22012-08-22 07:08

24 楼

zan!

b*n2012-08-22 07:08

25 楼

为什么没有可能？详解？我自己想到的就是virus不整合。

【在 r***e 的大作中提到】

: 这个基本没可能。
: 主要是高表达（多拷贝）的细胞没有选择优势。
:
: extrachromosoma
: 些未
: 表达

M*c2012-08-22 07:08

26 楼

真赞！

现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.
也要合适,必须在刚出锅三分钟左右之内吃完,这样糖还热,就能拔出很长的丝来,时机一
过,糖就凉了,如果这时还未吃完,这个菜就变成一砣焦糖粘红薯了.
,就这次做,也只敢做一个红薯的分量,呵呵.

【在 D**S 的大作中提到】

: 最近都不常来美食版了,这一来,香气扑鼻啊!
: 给大家拜个年,再在这里凑个热闹,发下除夕晚餐的照片.
: 这里大厨多,班门弄斧了,哈哈.
: -----------------------------------
: 因为人少吗,只有二人,所以就只做了六个菜:四荤二素/四热二凉.饺子是半夜前现做现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.
: 饮料配了红酒和VOSS矿泉水各一瓶.
: 最难"伺候"的一道菜是拔丝红薯,除了油炸红薯和糖稀的火候都要合适之外,吃的时机也要合适,必须在刚出锅三分钟左右之内吃完,这样糖还热,就能拔出很长的丝来,时机一过,糖就凉了,如果这时还未吃完,这个菜就变成一砣焦糖粘红薯了.
: 有人问了:这么油大糖多的菜,吃了得跑步多少分钟才能消耗掉啊?那是,平常哪敢吃啊,就这次做,也只敢做一个红薯的分量,呵呵.
: -----------------------------------

s*s2012-08-22 07:08

27 楼

换pgk吧。cmv这玩意儿虽然比较强，但是问题多多

【在 b*****n 的大作中提到】

: 就是CMV promoter

m*n2012-08-22 07:08

28 楼

都是我的最爱色香诱人赞

现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.
也要合适,必须在刚出锅三分钟左右之内吃完,这样糖还热,就能拔出很长的丝来,时机一
过,糖就凉了,如果这时还未吃完,这个菜就变成一砣焦糖粘红薯了.
,就这次做,也只敢做一个红薯的分量,呵呵.

【在 D**S 的大作中提到】

: 最近都不常来美食版了,这一来,香气扑鼻啊!
: 给大家拜个年,再在这里凑个热闹,发下除夕晚餐的照片.
: 这里大厨多,班门弄斧了,哈哈.
: -----------------------------------
: 因为人少吗,只有二人,所以就只做了六个菜:四荤二素/四热二凉.饺子是半夜前现做现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.
: 饮料配了红酒和VOSS矿泉水各一瓶.
: 最难"伺候"的一道菜是拔丝红薯,除了油炸红薯和糖稀的火候都要合适之外,吃的时机也要合适,必须在刚出锅三分钟左右之内吃完,这样糖还热,就能拔出很长的丝来,时机一过,糖就凉了,如果这时还未吃完,这个菜就变成一砣焦糖粘红薯了.
: 有人问了:这么油大糖多的菜,吃了得跑步多少分钟才能消耗掉啊?那是,平常哪敢吃啊,就这次做,也只敢做一个红薯的分量,呵呵.
: -----------------------------------

b*n2012-08-22 07:08

29 楼

这个可以一试。

【在 m*****z 的大作中提到】

: 先做个quantitative PCR看看copy number有没有下降吧
: 有下降说明表达该基因可能有生长劣势
: 没变化就很有可能是被silenced掉了
: lz转的什么细胞？

h*42012-08-22 07:08

30 楼

现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.
也要合适,必须在刚出锅三分钟左右之内吃完,这样糖还热,就能拔出很长的丝来,时机一
过,糖就凉了,如果这时还未吃完,这个菜就变成一砣焦糖粘红薯了.
,就这次做,也只敢做一个红薯的分量,呵呵.
你们俩人吃得也太丰盛了吧，我们除夕我都忘了吃的什么了

【在 D**S 的大作中提到】

: 最近都不常来美食版了,这一来,香气扑鼻啊!
: 给大家拜个年,再在这里凑个热闹,发下除夕晚餐的照片.
: 这里大厨多,班门弄斧了,哈哈.
: -----------------------------------
: 因为人少吗,只有二人,所以就只做了六个菜:四荤二素/四热二凉.饺子是半夜前现做现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.
: 饮料配了红酒和VOSS矿泉水各一瓶.
: 最难"伺候"的一道菜是拔丝红薯,除了油炸红薯和糖稀的火候都要合适之外,吃的时机也要合适,必须在刚出锅三分钟左右之内吃完,这样糖还热,就能拔出很长的丝来,时机一过,糖就凉了,如果这时还未吃完,这个菜就变成一砣焦糖粘红薯了.
: 有人问了:这么油大糖多的菜,吃了得跑步多少分钟才能消耗掉啊?那是,平常哪敢吃啊,就这次做,也只敢做一个红薯的分量,呵呵.
: -----------------------------------

b*n2012-08-22 07:08

31 楼

RNAi的construct是公司直接买的，做subcloning的话要费神了。

【在 s******s 的大作中提到】

: 换pgk吧。cmv这玩意儿虽然比较强，但是问题多多

D*S2012-08-22 07:08

32 楼

要说丰盛,你看看人家minigarden的年夜饭,也是两个人吃.

【在 h*********4 的大作中提到】

:
: 现吃的(猪肉/虾粒/韭菜馅的).菜名都在照片上了.
: 也要合适,必须在刚出锅三分钟左右之内吃完,这样糖还热,就能拔出很长的丝来,时机一
: 过,糖就凉了,如果这时还未吃完,这个菜就变成一砣焦糖粘红薯了.
: ,就这次做,也只敢做一个红薯的分量,呵呵.
: 你们俩人吃得也太丰盛了吧，我们除夕我都忘了吃的什么了

r*e2012-08-22 07:08

33 楼

除非你用的是特殊的integrate deficient的病毒，否则整合没什么问题。基本上就是转
进去的基因或shRNA对生长不利。最好报一下是什么细胞？
另外cmv没这么容易silence，除了es cell之类的。pgk表达量非常低。另外一种极端的
情况是，cmv受NFkB影响，如果你的基因能抑制NFkB。

【在 b*****n 的大作中提到】

: 为什么没有可能？详解？我自己想到的就是virus不整合。

s*72012-08-22 07:08

34 楼

X*n2012-08-22 07:08

35 楼

如果挑几个单克隆会不会好点呢？

r*e2012-08-22 07:08

36 楼

这个建议可以试试。
挑了单克隆你会发现，GFP表达少的细胞长的好。表达很高的很难活下来，所以另外一种
原因是GFP毒性。

【在 X******n 的大作中提到】

: 如果挑几个单克隆会不会好点呢？

a*a2012-08-22 07:08

37 楼

一般我用lenti都不做stable line，除非有生长优势，否则很容易丢掉。

h*n2012-08-22 07:08

38 楼

promoter被silence的情况要看细胞/组织类型.
可以试试不同的promoter, 有些比较强的mammalian promoter可能从长远来看更好.
不过我用CMV效果挺好的, 所以要看具体细胞类型.

s*s2012-08-22 07:08

39 楼

我说了，自己试验经验，除了es，有几个细胞系cmv也不行，当然也有
好用的时候，否则这个promoter也不会popular.
pgk一点也不低，算是中高的promoter，虽然比不上cmv，但是比大多数其他的强多了

是转

【在 r***e 的大作中提到】

: 除非你用的是特殊的integrate deficient的病毒，否则整合没什么问题。基本上就是转
: 进去的基因或shRNA对生长不利。最好报一下是什么细胞？
: 另外cmv没这么容易silence，除了es cell之类的。pgk表达量非常低。另外一种极端的
: 情况是，cmv受NFkB影响，如果你的基因能抑制NFkB。

w*a2012-08-22 07:08

40 楼

gfp 未必和基因同一个启动子。

【在 b*****n 的大作中提到】

: 用Lenti Virus感染细胞，第一二代效果非常好，过表达的达到几百倍，Knock down的
: 达到90%的效率。但是传了三四代之后，过表达的只有几倍了，而knock down的几乎没
: 有看到效果。
: Lenti virus同时携带GFP，可以看到传过几代之后，GFP还在，但是亮度大大下降。
: 以上的细胞还经过GFP的sorting后传代。
: 版上各位有否碰到类似的现象？如何解决？

s*y2012-08-22 07:08

41 楼

如果是IRES的话，也经常有不表达下游基因的情况发生

【在 w***a 的大作中提到】

: gfp 未必和基因同一个启动子。

q*g2012-08-22 07:08

42 楼

我一般sorting之后，就冻起来一批。培养3-4代后，就换新的。

r*e2012-08-22 07:08

43 楼

我用的不多，但是自己经验是pgk比cmv弱很多（只有10-20%）。
你说的大多数有哪些？我想了解一下，当然说的是通用promoter，不是tissue-specifi
c promoter。

【在 s******s 的大作中提到】

: 我说了，自己试验经验，除了es，有几个细胞系cmv也不行，当然也有
: 好用的时候，否则这个promoter也不会popular.
: pgk一点也不低，算是中高的promoter，虽然比不上cmv，但是比大多数其他的强多了
:
: 是转