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讨论:信号通路上的蛋白酶功能研究策略哪种好?
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讨论:信号通路上的蛋白酶功能研究策略哪种好?# Biology - 生物学
a*n
1
两个包子换
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W*n
2
想在一个无脊椎动物(和果蝇比较近)中研究一个信号通路上的蛋白酶(通过被磷酸化
起作用)的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
1)过量表达蛋白,
2)抑制蛋白表达,包括SiRNA干扰,ds-RNA干扰,Mopholino阻断表达,或者negative
-dominant overexpression
由于蛋白酶需要磷酸化后起作用,而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分,觉
得即使蛋白水平上有一些变化,在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法,能够更
容易看到变化呢?
请做过的朋友发表一下意见,那种方法比较好?
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w*r
3
其实RNAi的结果基本就能说明问题了。过表达的话可以在磷酸化位点做突变。类似于激
酶里的E或者D突变,或DN
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s*r
4
有没有constitutive active mutant,可以overexpression.

negative

【在 W*********n 的大作中提到】
: 想在一个无脊椎动物(和果蝇比较近)中研究一个信号通路上的蛋白酶(通过被磷酸化
: 起作用)的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
: 1)过量表达蛋白,
: 2)抑制蛋白表达,包括SiRNA干扰,ds-RNA干扰,Mopholino阻断表达,或者negative
: -dominant overexpression
: 由于蛋白酶需要磷酸化后起作用,而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分,觉
: 得即使蛋白水平上有一些变化,在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法,能够更
: 容易看到变化呢?
: 请做过的朋友发表一下意见,那种方法比较好?

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K*4
5
把蛋白酶的活性氨基酸突变了

negative

【在 W*********n 的大作中提到】
: 想在一个无脊椎动物(和果蝇比较近)中研究一个信号通路上的蛋白酶(通过被磷酸化
: 起作用)的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
: 1)过量表达蛋白,
: 2)抑制蛋白表达,包括SiRNA干扰,ds-RNA干扰,Mopholino阻断表达,或者negative
: -dominant overexpression
: 由于蛋白酶需要磷酸化后起作用,而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分,觉
: 得即使蛋白水平上有一些变化,在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法,能够更
: 容易看到变化呢?
: 请做过的朋友发表一下意见,那种方法比较好?

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W*n
6
RNAi不是有脱靶的问题吗? 以前没有做过,所以对这个问题是否严重没有很好的把握
。这个蛋白的磷酸化位点不能突变成模拟磷酸化的蛋白,所以这条道路不通。

【在 w********r 的大作中提到】
: 其实RNAi的结果基本就能说明问题了。过表达的话可以在磷酸化位点做突变。类似于激
: 酶里的E或者D突变,或DN

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W*n
7
您是说突变体的生物个体吗?还是插入质粒用来过表达组成性的,失去功能的蛋白?

【在 s******r 的大作中提到】
: 有没有constitutive active mutant,可以overexpression.
:
: negative

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W*n
8
您是说生成突变体的生物个体?还是通过质粒过量表达突变了活性氨基酸的蛋白?

【在 K**4 的大作中提到】
: 把蛋白酶的活性氨基酸突变了
:
: negative

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w*r
9
通常认为RNAi结果比过表达可靠。
用多条siRNA,再用cDNA rescue可以证明看到的表型是否是脱靶导致
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K*4
10
生成突变体的生物个体
如果有条件的话

【在 W*********n 的大作中提到】
: 您是说生成突变体的生物个体?还是通过质粒过量表达突变了活性氨基酸的蛋白?
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l*1
11
LZ can try long hairpin RNAi
Reference:
Tomimoto K et al. (2012)
Construction of a long hairpin RNA expression library using Cre recombinase.
J Biotechnol. 160: 129-39.
PubMed link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22484114

发信人: Wanshington (Joudon), 信区: Biology
标 题: Re: 讨论:信号通路上的蛋白酶功能研究策略哪种好?
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Sep 28 03:33:37 2012, 美东)
RNAi不是有脱靶的问题吗? 以前没有做过,所以对这个问题是否严重没有很好的把握
。这个蛋白的磷酸化位点不能突变成模拟磷酸化的蛋白,所以这条道路不通。

【在 w********r 的大作中提到】
: 其实RNAi的结果基本就能说明问题了。过表达的话可以在磷酸化位点做突变。类似于激
: 酶里的E或者D突变,或DN

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