W*n
2 楼
想在一个无脊椎动物(和果蝇比较近)中研究一个信号通路上的蛋白酶(通过被磷酸化
起作用)的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
1)过量表达蛋白,
2)抑制蛋白表达,包括SiRNA干扰,ds-RNA干扰,Mopholino阻断表达,或者negative
-dominant overexpression
由于蛋白酶需要磷酸化后起作用,而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分,觉
得即使蛋白水平上有一些变化,在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法,能够更
容易看到变化呢?
请做过的朋友发表一下意见,那种方法比较好?
起作用)的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
1)过量表达蛋白,
2)抑制蛋白表达,包括SiRNA干扰,ds-RNA干扰,Mopholino阻断表达,或者negative
-dominant overexpression
由于蛋白酶需要磷酸化后起作用,而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分,觉
得即使蛋白水平上有一些变化,在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法,能够更
容易看到变化呢?
请做过的朋友发表一下意见,那种方法比较好?
w*r
3 楼
其实RNAi的结果基本就能说明问题了。过表达的话可以在磷酸化位点做突变。类似于激
酶里的E或者D突变,或DN
酶里的E或者D突变,或DN
s*r
4 楼
有没有constitutive active mutant,可以overexpression.
negative
【在 W*********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 想在一个无脊椎动物(和果蝇比较近)中研究一个信号通路上的蛋白酶(通过被磷酸化
: 起作用)的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
: 1)过量表达蛋白,
: 2)抑制蛋白表达,包括SiRNA干扰,ds-RNA干扰,Mopholino阻断表达,或者negative
: -dominant overexpression
: 由于蛋白酶需要磷酸化后起作用,而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分,觉
: 得即使蛋白水平上有一些变化,在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法,能够更
: 容易看到变化呢?
: 请做过的朋友发表一下意见,那种方法比较好?
negative
【在 W*********n 的大作中提到】
![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 想在一个无脊椎动物(和果蝇比较近)中研究一个信号通路上的蛋白酶(通过被磷酸化
: 起作用)的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
: 1)过量表达蛋白,
: 2)抑制蛋白表达,包括SiRNA干扰,ds-RNA干扰,Mopholino阻断表达,或者negative
: -dominant overexpression
: 由于蛋白酶需要磷酸化后起作用,而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分,觉
: 得即使蛋白水平上有一些变化,在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法,能够更
: 容易看到变化呢?
: 请做过的朋友发表一下意见,那种方法比较好?
K*4
5 楼
把蛋白酶的活性氨基酸突变了
negative
【在 W*********n 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 想在一个无脊椎动物(和果蝇比较近)中研究一个信号通路上的蛋白酶(通过被磷酸化
: 起作用)的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
: 1)过量表达蛋白,
: 2)抑制蛋白表达,包括SiRNA干扰,ds-RNA干扰,Mopholino阻断表达,或者negative
: -dominant overexpression
: 由于蛋白酶需要磷酸化后起作用,而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分,觉
: 得即使蛋白水平上有一些变化,在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法,能够更
: 容易看到变化呢?
: 请做过的朋友发表一下意见,那种方法比较好?
negative
【在 W*********n 的大作中提到】
![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 想在一个无脊椎动物(和果蝇比较近)中研究一个信号通路上的蛋白酶(通过被磷酸化
: 起作用)的功能。在细胞水平和个体水平上研究。
: 1)过量表达蛋白,
: 2)抑制蛋白表达,包括SiRNA干扰,ds-RNA干扰,Mopholino阻断表达,或者negative
: -dominant overexpression
: 由于蛋白酶需要磷酸化后起作用,而在信息传递过程被磷酸化的蛋白总是一小部分,觉
: 得即使蛋白水平上有一些变化,在磷酸化水平上变化也不大。那么用什么方法,能够更
: 容易看到变化呢?
: 请做过的朋友发表一下意见,那种方法比较好?
w*r
9 楼
通常认为RNAi结果比过表达可靠。
用多条siRNA,再用cDNA rescue可以证明看到的表型是否是脱靶导致
用多条siRNA,再用cDNA rescue可以证明看到的表型是否是脱靶导致
l*1
11 楼
LZ can try long hairpin RNAi
Reference:
Tomimoto K et al. (2012)
Construction of a long hairpin RNA expression library using Cre recombinase.
J Biotechnol. 160: 129-39.
PubMed link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22484114
发信人: Wanshington (Joudon), 信区: Biology
标 题: Re: 讨论:信号通路上的蛋白酶功能研究策略哪种好?
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Sep 28 03:33:37 2012, 美东)
RNAi不是有脱靶的问题吗? 以前没有做过,所以对这个问题是否严重没有很好的把握
。这个蛋白的磷酸化位点不能突变成模拟磷酸化的蛋白,所以这条道路不通。
【在 w********r 的大作中提到】![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 其实RNAi的结果基本就能说明问题了。过表达的话可以在磷酸化位点做突变。类似于激
: 酶里的E或者D突变,或DN
Reference:
Tomimoto K et al. (2012)
Construction of a long hairpin RNA expression library using Cre recombinase.
J Biotechnol. 160: 129-39.
PubMed link:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22484114
发信人: Wanshington (Joudon), 信区: Biology
标 题: Re: 讨论:信号通路上的蛋白酶功能研究策略哪种好?
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Sep 28 03:33:37 2012, 美东)
RNAi不是有脱靶的问题吗? 以前没有做过,所以对这个问题是否严重没有很好的把握
。这个蛋白的磷酸化位点不能突变成模拟磷酸化的蛋白,所以这条道路不通。
【在 w********r 的大作中提到】
![](/moin_static193/solenoid/img/up.png)
: 其实RNAi的结果基本就能说明问题了。过表达的话可以在磷酸化位点做突变。类似于激
: 酶里的E或者D突变,或DN
相关阅读
庆祝一下,我下岗了,好开心[请问]一般来说,质粒上AmpR/KanR gene的terminator是什么?Re: 感叹一下现在的中国postdoc (转载)BME有前途么?招技术员, MIT/HMS论名字的重要新,兼谈大科学结构生物学即将步测序后尘?太勤奋是多数国人的弊端科研领域创业:同伴召唤帖(bssd) 庆祝一下,我又准备好好上岗搞生物科研了Genetech职位比较有没有类似于BioID或者DamID的但适用于RNA的技术用表达IGF1的病毒 感染293T,WB却检测不到蛋白的表达,是都分泌出去了吗?庆祝一下,我也要下岗了求一篇文章,谢谢中国科学通报是个好杂志,以后中国的诺奖级别的工作理应推荐发表于此好的QPCRsystem求推荐一下ChIP好用的GFP, Myc和HA的抗体问个RNAseq检测mRNA变化的问题。下个月SFN芝加哥年会有人合住吗, 仅限男性