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这个实验设计靠谱吗

这个实验设计靠谱吗# Biology - 生物学

C*82012-10-02 07:10

1 楼

已知一个signalling pathway 磷酸化一个transcription factor A 来调控下游基因的
表达，但A可能也受其他的调控
如果要看这个信号通路通过A调控的基因，分别做wt 下 A的ChIP-seq 和信号通路失活
下A的ChIP-seq进行比较，是否可行
此外，如果钱有限的情况下，mRNA-seq 或者 ChIP-seq 哪个更有说明力一些
多谢了

u*d2012-10-02 07:10

2 楼

“已知一个signalling pathway 磷酸化一个transcription factor A 来调控下游基因
的表达”——
具体依据是什么？
既然已知，还找什么呢？

m*n2012-10-02 07:10

3 楼

我做一个seminar的时候被问过类似的问题
既然你已经知道TF A可以调控这7个基因了
为什么还要做ChIP-seq再去找其他的
不过问题是这7个是否够，而且我个人比较喜欢穷尽法
而且ChIP后有可能发现新的pathways被这个TF调控
这个是我当时的回答
期待comments，我也不确定这个是不是对的

【在 u**********d 的大作中提到】

: “已知一个signalling pathway 磷酸化一个transcription factor A 来调控下游基因
: 的表达”——
: 具体依据是什么？
: 既然已知，还找什么呢？

t*22012-10-02 07:10

4 楼

楼主是要找下游的靶基因。chip-seq是可以的。但是chip-seq的control组应该用IgG就
可以了，当然如果你有什么试剂能特异的阻断这条pathway也可以，但可能对chip的结
果会有影响。RNA-seq是不合适的

l*e2012-10-02 07:10

5 楼

简单答案最好都做
如果实在不能都做,
问问自己
1) in vivo还是in vitro? in vitro用什么系统? in vivo用什么系统?
2) 有没有好的antibody?
个人觉得chip-seq不好做. TF的Chip-seq不比histone modification的chip-seq 需要
很好的Ab和很多的cell, 多数只能在cell line/primary cell做.

【在 C******8 的大作中提到】

: 已知一个signalling pathway 磷酸化一个transcription factor A 来调控下游基因的
: 表达，但A可能也受其他的调控
: 如果要看这个信号通路通过A调控的基因，分别做wt 下 A的ChIP-seq 和信号通路失活
: 下A的ChIP-seq进行比较，是否可行
: 此外，如果钱有限的情况下，mRNA-seq 或者 ChIP-seq 哪个更有说明力一些
: 多谢了

l*e2012-10-02 07:10

6 楼

IgG control = 没有 control

【在 t*****2 的大作中提到】

: 楼主是要找下游的靶基因。chip-seq是可以的。但是chip-seq的control组应该用IgG就
: 可以了，当然如果你有什么试剂能特异的阻断这条pathway也可以，但可能对chip的结
: 果会有影响。RNA-seq是不合适的

s*s2012-10-02 07:10

7 楼

right. 除非别人做过，有现成的antibody和实验条件。否则TF的
ChIP-seq是很难做的.

【在 l********e 的大作中提到】

: 简单答案最好都做
: 如果实在不能都做,
: 问问自己
: 1) in vivo还是in vitro? in vitro用什么系统? in vivo用什么系统?
: 2) 有没有好的antibody?
: 个人觉得chip-seq不好做. TF的Chip-seq不比histone modification的chip-seq 需要
: 很好的Ab和很多的cell, 多数只能在cell line/primary cell做.

C*82012-10-02 07:10

8 楼

汗，难道我的表达这么有问题吗？
比如 JNK---TF A------(b,c,d...)
b,c,d是已知的被JNK通过TF A调控的基因，我还想找更加多的JNK-TF A--？
用 TF A 的 ChIP-seq
但同时 TF A也许有不依赖于JNK，而是被其他通路比如Notch, Wnt 调控而产生的功能
，因此，对照组用 JNK被阻断后 TF A的 ChIP-seq
这样可以找到JNK-TF A--？但不是 Notch/Wnt--TF A 的下游基因
这样考虑对吗？

【在 t*****2 的大作中提到】

C*82012-10-02 07:10

9 楼

那应该怎么control
我没坐过ChIP-seq，以前做ChIP时用的是Rabbit来源的antibody,然后用Normal Serum
做control，结果用rp49 normalize，应该算很常规的做法了

【在 l********e 的大作中提到】

: IgG control = 没有 control

C*82012-10-02 07:10

10 楼

能问一下为什么吗？我只坐过ChIP,还没做过ChIP-seq,只知道要用特定的kit
那种kit比较好？
此外，如果用内源表达的加了tag的gene, 用anti-tag的抗体，应该会好做一点吗？

【在 s******s 的大作中提到】

: right. 除非别人做过，有现成的antibody和实验条件。否则TF的
: ChIP-seq是很难做的.

u*d2012-10-02 07:10

11 楼

能找更多的当然好了。我是对楼主的问题不太理解。

【在 m*******n 的大作中提到】

: 我做一个seminar的时候被问过类似的问题
: 既然你已经知道TF A可以调控这7个基因了
: 为什么还要做ChIP-seq再去找其他的
: 不过问题是这7个是否够，而且我个人比较喜欢穷尽法
: 而且ChIP后有可能发现新的pathways被这个TF调控
: 这个是我当时的回答
: 期待comments，我也不确定这个是不是对的

u*d2012-10-02 07:10

12 楼

可能这里还是要看看上游的pathway到底怎么影响这个TF的。影响nuclear
localization？stability？specificity？
IgG当然是要的，但最好还有一个pathway变化前后的相互对照。

【在 t*****2 的大作中提到】

u*d2012-10-02 07:10

13 楼

对，最好都做。结合到一个基因上面或者附近不代表就调控它了，还得真的影响到它的
表达才行；反过来某个基因表达变化了，但是目的TF都没结合在上面，那么很可能是其
他人干的。

【在 l********e 的大作中提到】

y*j2012-10-02 07:10

14 楼

Chip-Seq做完了，target不多，直接qPCR western啥的就解决了。

【在 u**********d 的大作中提到】

: 对，最好都做。结合到一个基因上面或者附近不代表就调控它了，还得真的影响到它的
: 表达才行；反过来某个基因表达变化了，但是目的TF都没结合在上面，那么很可能是其
: 他人干的。

u*d2012-10-02 07:10

15 楼

如果少量过表达你的TF（比如挑一个克隆，exogenous与endogenous量差不多）对你已
经得到的那些主要结果没影响的话，还是很有用的。可以带两个tag，比如FLAG和HA，
这样的结果就更可靠了。但是变态的reviewer可能还是会要你endogenous的结果，TNND！

【在 C******8 的大作中提到】

:
: 能问一下为什么吗？我只坐过ChIP,还没做过ChIP-seq,只知道要用特定的kit
: 那种kit比较好？
: 此外，如果用内源表达的加了tag的gene, 用anti-tag的抗体，应该会好做一点吗？

u*d2012-10-02 07:10

16 楼

target不会少的，如果ChIP抗体不好用或者做的不好，就更坑爹了

【在 y***j 的大作中提到】

: Chip-Seq做完了，target不多，直接qPCR western啥的就解决了。