c*0
2 楼
I-140表的Part6中的 7. Is this a permanent position?
是否永久职位？（皮匠的博客里说，注意：申请移民的前提是有一个永久职位） YES
or NO ???
可我的OFFER信中的职位是Visiting Scholar,但学校给我申请是H1B。这种情况申请
EB1A，上面这个问题应该填什么？？？YES or NO ???
是否永久职位？（皮匠的博客里说，注意：申请移民的前提是有一个永久职位） YES
or NO ???
可我的OFFER信中的职位是Visiting Scholar,但学校给我申请是H1B。这种情况申请
EB1A，上面这个问题应该填什么？？？YES or NO ???
H*O
3 楼
我有3个ChIP，分别是IgG control，KD＋抗体，Scr＋抗体.已经做了library，现在要
混在一起在一个lane测序，要等量地混起来。
1. 请问这个等量是不是要非常精确？测序不是根据reads的数量来定量吗，那混的时候
差异会不会对结果影响很大？
2. 做好的library，用Qubit和bioanalyzer测出来的浓度不一样啊，该采用哪一个？
非常感谢！！
混在一起在一个lane测序，要等量地混起来。
1. 请问这个等量是不是要非常精确？测序不是根据reads的数量来定量吗，那混的时候
差异会不会对结果影响很大？
2. 做好的library，用Qubit和bioanalyzer测出来的浓度不一样啊，该采用哪一个？
非常感谢！！
S*t
4 楼
我的是收到就能查到了
A*d
5 楼
You don't need to file this section if you apply EB1A and NIW.
l*i
6 楼
用barcode sequence区分这三组
L*i
7 楼
你是哪个center啊
c*0
8 楼
是不是申请EB1A和NIW， I-140表中的Part 6可以不填？？？？？？
H*O
9 楼
不是这个问题。index是加了的。
我是想问，混合的时候，是不是要精准地一样？不然定量还准不准？定量是直接比较各
组的reads数，还是有内参？
【在 l*******i 的大作中提到】
: 用barcode sequence区分这三组
我是想问，混合的时候，是不是要精准地一样？不然定量还准不准？定量是直接比较各
组的reads数，还是有内参？
【在 l*******i 的大作中提到】
: 用barcode sequence区分这三组
b*u
10 楼
我收到receipt后，过了三周多网上才可以查的
等的时候给uscis打过电话，说是有一部分要等30天才能track
我是csc的
【在 l*******g 的大作中提到】
: 收到receipt快3周了，网上还是查不到状态
: 大家是怎么样的啊？多谢
等的时候给uscis打过电话，说是有一部分要等30天才能track
我是csc的
【在 l*******g 的大作中提到】
: 收到receipt快3周了，网上还是查不到状态
: 大家是怎么样的啊？多谢
c*0
11 楼
想这个周末E-FILE140， 到底要不要填呢？？？？？？？
y*3
12 楼
各库的浓度要尽量的相等，测出的reads数才会越相近
l*g
13 楼
我是LIN的
打电话过去，说可能要30-40天网上才能查到
【在 L*****i 的大作中提到】
: 你是哪个center啊
打电话过去，说可能要30-40天网上才能查到
【在 L*****i 的大作中提到】
: 你是哪个center啊
k*w
14 楼
FYI: 我申请NIW的时候填了NO，没有问题，一个月就approve了
i*i
15 楼
根据我的经验，Qubit会underestimate library的浓度，而用bioanalyzer则准确的多
。此外还有用real-time PCR来估计浓度的，线性关系非常的好。
但是，即便是library的浓度估计得再准确，测出来的也会有偏差，大概在20%左右。例
如200M的总reads，10个sample的话，差异大概从16-25M都会有。
barcode越多，变异越大，上次我们用Hiseq2500测序，混了16个sample，变异就非常大。
此外，很少会测IgG的库，一般来说建议测一个input。好像MACS需要用到input来做
peak calling。
。此外还有用real-time PCR来估计浓度的，线性关系非常的好。
但是，即便是library的浓度估计得再准确，测出来的也会有偏差，大概在20%左右。例
如200M的总reads，10个sample的话，差异大概从16-25M都会有。
barcode越多，变异越大，上次我们用Hiseq2500测序，混了16个sample，变异就非常大。
此外，很少会测IgG的库，一般来说建议测一个input。好像MACS需要用到input来做
peak calling。
c*0
16 楼
楼上是说，不用填I-140表中的part6???????
s*s
17 楼
1.要尽量准啦。不过只有三个样品，不准问题也不大。
2.应该是Qubit准。bioanalyzer低浓度有时候瞎算啊
【在 H**O 的大作中提到】
: 我有3个ChIP，分别是IgG control，KD＋抗体，Scr＋抗体.已经做了library，现在要
: 混在一起在一个lane测序，要等量地混起来。
: 1. 请问这个等量是不是要非常精确？测序不是根据reads的数量来定量吗，那混的时候
: 差异会不会对结果影响很大？
: 2. 做好的library，用Qubit和bioanalyzer测出来的浓度不一样啊，该采用哪一个？
: 非常感谢！！
2.应该是Qubit准。bioanalyzer低浓度有时候瞎算啊
【在 H**O 的大作中提到】
: 我有3个ChIP，分别是IgG control，KD＋抗体，Scr＋抗体.已经做了library，现在要
: 混在一起在一个lane测序，要等量地混起来。
: 1. 请问这个等量是不是要非常精确？测序不是根据reads的数量来定量吗，那混的时候
: 差异会不会对结果影响很大？
: 2. 做好的library，用Qubit和bioanalyzer测出来的浓度不一样啊，该采用哪一个？
: 非常感谢！！
c*0
18 楼
没人回！！！！！！！！！！！！
H*O
19 楼
谢谢！input也要测啊？我没有做input的library 。
大。
【在 i*****i 的大作中提到】
: 根据我的经验，Qubit会underestimate library的浓度，而用bioanalyzer则准确的多
: 。此外还有用real-time PCR来估计浓度的，线性关系非常的好。
: 但是，即便是library的浓度估计得再准确，测出来的也会有偏差，大概在20%左右。例
: 如200M的总reads，10个sample的话，差异大概从16-25M都会有。
: barcode越多，变异越大，上次我们用Hiseq2500测序，混了16个sample，变异就非常大。
: 此外，很少会测IgG的库，一般来说建议测一个input。好像MACS需要用到input来做
: peak calling。
大。
【在 i*****i 的大作中提到】
: 根据我的经验，Qubit会underestimate library的浓度，而用bioanalyzer则准确的多
: 。此外还有用real-time PCR来估计浓度的，线性关系非常的好。
: 但是，即便是library的浓度估计得再准确，测出来的也会有偏差，大概在20%左右。例
: 如200M的总reads，10个sample的话，差异大概从16-25M都会有。
: barcode越多，变异越大，上次我们用Hiseq2500测序，混了16个sample，变异就非常大。
: 此外，很少会测IgG的库，一般来说建议测一个input。好像MACS需要用到input来做
: peak calling。
H*O
20 楼
有没有内参校正呢？
Qubit在什么范围内比bioanalyzer准确呢？
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.要尽量准啦。不过只有三个样品，不准问题也不大。
: 2.应该是Qubit准。bioanalyzer低浓度有时候瞎算啊
Qubit在什么范围内比bioanalyzer准确呢？
【在 s******s 的大作中提到】
: 1.要尽量准啦。不过只有三个样品，不准问题也不大。
: 2.应该是Qubit准。bioanalyzer低浓度有时候瞎算啊
i*i
21 楼
如果你有高浓度的PCR产物的话，可以考虑用nanodrop，或者传统的石英杯子侧浓度。
然后做serial dilution,做标准曲线。
一定要用PCR产物，质粒不可以。用质粒结果极其诡异。
我自己做的library，一般10ng/ul, 总量100-150ng，Bioanalyzer还算准确。
如果能自己用bioanalyzer最好，如果是Core做的话，一定要注意峰的面积是怎么算的
，那个分析软件有时候很crazy。
然后做serial dilution,做标准曲线。
一定要用PCR产物，质粒不可以。用质粒结果极其诡异。
我自己做的library，一般10ng/ul, 总量100-150ng，Bioanalyzer还算准确。
如果能自己用bioanalyzer最好，如果是Core做的话，一定要注意峰的面积是怎么算的
，那个分析软件有时候很crazy。
H*O
22 楼
谢谢指教。
你上面说“用real-time PCR来估计浓度的” -----请问这个怎么做？我ChIP的这个基
因还不知道target gene是什么啊，怎么做Q-PCR呢？有通用引物？
我有biolanalyzer的，也算了峰面积，跟Qubit差得太多了。我就按Qubit的浓度了，有
人说问题不大。
没有input的测序，用MACS做peak calling会不会是个问题啊？不能用reference
genome吗？
【在 i*****i 的大作中提到】
: 如果你有高浓度的PCR产物的话，可以考虑用nanodrop，或者传统的石英杯子侧浓度。
: 然后做serial dilution,做标准曲线。
: 一定要用PCR产物，质粒不可以。用质粒结果极其诡异。
: 我自己做的library，一般10ng/ul, 总量100-150ng，Bioanalyzer还算准确。
: 如果能自己用bioanalyzer最好，如果是Core做的话，一定要注意峰的面积是怎么算的
: ，那个分析软件有时候很crazy。
你上面说“用real-time PCR来估计浓度的” -----请问这个怎么做？我ChIP的这个基
因还不知道target gene是什么啊，怎么做Q-PCR呢？有通用引物？
我有biolanalyzer的，也算了峰面积，跟Qubit差得太多了。我就按Qubit的浓度了，有
人说问题不大。
没有input的测序，用MACS做peak calling会不会是个问题啊？不能用reference
genome吗？
【在 i*****i 的大作中提到】
: 如果你有高浓度的PCR产物的话，可以考虑用nanodrop，或者传统的石英杯子侧浓度。
: 然后做serial dilution,做标准曲线。
: 一定要用PCR产物，质粒不可以。用质粒结果极其诡异。
: 我自己做的library，一般10ng/ul, 总量100-150ng，Bioanalyzer还算准确。
: 如果能自己用bioanalyzer最好，如果是Core做的话，一定要注意峰的面积是怎么算的
: ，那个分析软件有时候很crazy。
l*i
23 楼
我也在纳闷，就是这种IgG或者其他Negative Control，理论上是不会有DNA的。怎么收
集到10ng的DNA。
另外有个问题就是如果我的样品有重复（2个生物学重复），Input需要重复么？
大。
【在 i*****i 的大作中提到】
: 根据我的经验，Qubit会underestimate library的浓度，而用bioanalyzer则准确的多
: 。此外还有用real-time PCR来估计浓度的，线性关系非常的好。
: 但是，即便是library的浓度估计得再准确，测出来的也会有偏差，大概在20%左右。例
: 如200M的总reads，10个sample的话，差异大概从16-25M都会有。
: barcode越多，变异越大，上次我们用Hiseq2500测序，混了16个sample，变异就非常大。
: 此外，很少会测IgG的库，一般来说建议测一个input。好像MACS需要用到input来做
: peak calling。
集到10ng的DNA。
另外有个问题就是如果我的样品有重复（2个生物学重复），Input需要重复么？
大。
【在 i*****i 的大作中提到】
: 根据我的经验，Qubit会underestimate library的浓度，而用bioanalyzer则准确的多
: 。此外还有用real-time PCR来估计浓度的，线性关系非常的好。
: 但是，即便是library的浓度估计得再准确，测出来的也会有偏差，大概在20%左右。例
: 如200M的总reads，10个sample的话，差异大概从16-25M都会有。
: barcode越多，变异越大，上次我们用Hiseq2500测序，混了16个sample，变异就非常大。
: 此外，很少会测IgG的库，一般来说建议测一个input。好像MACS需要用到input来做
: peak calling。
i*i
24 楼
对于qPCR定量，参考下面这个链接：
http://support.illumina.com/documents/MyIllumina/e4a1cd4c-9293-
或者放狗
Sequencing Library qPCR Quantification Guide - Support - Illumina
或者看看 KAPA Library Quant Kits
最好用KAPA的SYBR来做，便宜的 例如 Promega的SYBR干不了这么高端的活。
其实就是用通用引物来做PCR。
Reference genome应该是用来做mapping的吧。具体的我也不是很清楚，
你可以参考liu xiaole的网站，或者galaxy的教程
【在 H**O 的大作中提到】
: 谢谢指教。
: 你上面说“用real-time PCR来估计浓度的” -----请问这个怎么做？我ChIP的这个基
: 因还不知道target gene是什么啊，怎么做Q-PCR呢？有通用引物？
: 我有biolanalyzer的，也算了峰面积，跟Qubit差得太多了。我就按Qubit的浓度了，有
: 人说问题不大。
: 没有input的测序，用MACS做peak calling会不会是个问题啊？不能用reference
: genome吗？
http://support.illumina.com/documents/MyIllumina/e4a1cd4c-9293-
或者放狗
Sequencing Library qPCR Quantification Guide - Support - Illumina
或者看看 KAPA Library Quant Kits
最好用KAPA的SYBR来做，便宜的 例如 Promega的SYBR干不了这么高端的活。
其实就是用通用引物来做PCR。
Reference genome应该是用来做mapping的吧。具体的我也不是很清楚，
你可以参考liu xiaole的网站，或者galaxy的教程
【在 H**O 的大作中提到】
: 谢谢指教。
: 你上面说“用real-time PCR来估计浓度的” -----请问这个怎么做？我ChIP的这个基
: 因还不知道target gene是什么啊，怎么做Q-PCR呢？有通用引物？
: 我有biolanalyzer的，也算了峰面积，跟Qubit差得太多了。我就按Qubit的浓度了，有
: 人说问题不大。
: 没有input的测序，用MACS做peak calling会不会是个问题啊？不能用reference
: genome吗？
k*n
25 楼
大概均分就好了，一定范围内都没问题的。qpcr测的是相对分子数目，比较精确，
bioanalyzer比Qubit准。
bioanalyzer比Qubit准。
i*i
26 楼
IgG是可以pull down下来DNA的，甚至大部分时候和目的抗体pull down的DNA差不多 4-
5ng左右。
我们实验室的protocol很固定，所以我们觉得一个input可以用来分析所有的CHIP-seq
数据。有时候不同人用不同的protocol，或者用的细胞数量不一样，都会影响
sonication的效率，和片段大小，这样对input稍有影响，不过应该不是问题。
ChIP本来重复性就差，同一个人做相同的实验，seq结果能overlap 80%就相当好了。
【在 l*****i 的大作中提到】
: 我也在纳闷，就是这种IgG或者其他Negative Control，理论上是不会有DNA的。怎么收
: 集到10ng的DNA。
: 另外有个问题就是如果我的样品有重复（2个生物学重复），Input需要重复么？
:
: 大。
5ng左右。
我们实验室的protocol很固定，所以我们觉得一个input可以用来分析所有的CHIP-seq
数据。有时候不同人用不同的protocol，或者用的细胞数量不一样，都会影响
sonication的效率，和片段大小，这样对input稍有影响，不过应该不是问题。
ChIP本来重复性就差，同一个人做相同的实验，seq结果能overlap 80%就相当好了。
【在 l*****i 的大作中提到】
: 我也在纳闷，就是这种IgG或者其他Negative Control，理论上是不会有DNA的。怎么收
: 集到10ng的DNA。
: 另外有个问题就是如果我的样品有重复（2个生物学重复），Input需要重复么？
:
: 大。
k*n
27 楼
我一般input少load一些，大概是chip摩尔浓度的一半
j*p
28 楼
1. input必须要，和用什么软件call peak 无关。
2. 如果没有input，MACS call peak 的时候，没有FDR。
【在 H**O 的大作中提到】
: 谢谢指教。
: 你上面说“用real-time PCR来估计浓度的” -----请问这个怎么做？我ChIP的这个基
: 因还不知道target gene是什么啊，怎么做Q-PCR呢？有通用引物？
: 我有biolanalyzer的，也算了峰面积，跟Qubit差得太多了。我就按Qubit的浓度了，有
: 人说问题不大。
: 没有input的测序，用MACS做peak calling会不会是个问题啊？不能用reference
: genome吗？
2. 如果没有input，MACS call peak 的时候，没有FDR。
【在 H**O 的大作中提到】
: 谢谢指教。
: 你上面说“用real-time PCR来估计浓度的” -----请问这个怎么做？我ChIP的这个基
: 因还不知道target gene是什么啊，怎么做Q-PCR呢？有通用引物？
: 我有biolanalyzer的，也算了峰面积，跟Qubit差得太多了。我就按Qubit的浓度了，有
: 人说问题不大。
: 没有input的测序，用MACS做peak calling会不会是个问题啊？不能用reference
: genome吗？
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