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又熟悉NfkB的大牛吗？EMSA和luciferase reporter的结果不一致，请教！
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f*d
2 楼
小妹刚刚开始做NfkB pathway.
想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
DNA 序列会跟这个reporter的DNA序列不一样呢？请牛人指导一下吧！
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S*s
4 楼
我觉得你luciferase assay有问题。
一般TNF刺激, NF-KB luc reporter应该有100 fold左右的差别。
According to 某免疫大牛，<10 fold的他们认为太trivial
可以QPCR做几个下游的基因看看
另外如果真的觉得有变化，不妨做RNASeq or array.

biotin
treatment
EMSA

【在 f*******d 的大作中提到】
: 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
: 想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
: 了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
: labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
: 然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
: luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
: TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
: 确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
: DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
: GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
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f*d
6 楼
多谢！ 但是他的下游基因太多了，不知道从哪几个入手，有必要买一个qPCR array 吗？

【在 S*********s 的大作中提到】
: 我觉得你luciferase assay有问题。
: 一般TNF刺激, NF-KB luc reporter应该有100 fold左右的差别。
: According to 某免疫大牛，<10 fold的他们认为太trivial
: 可以QPCR做几个下游的基因看看
: 另外如果真的觉得有变化，不妨做RNASeq or array.
:
: biotin
: treatment
: EMSA
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s*n
7 楼
really good, repeating
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S*s
8 楼
看看 David Baltimore的paper

biotin
treatment
EMSA

【在 f*******d 的大作中提到】
: 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
: 想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
: 了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
: labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
: 然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
: luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
: TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
: 确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
: DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
: GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
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x*h
9 楼

从他发的微博来看，可能为人有点冲，恨不得在围脖里揭黑幕的主，这种搅屎棍任何圈
子都不敢接

【在 W*******d 的大作中提到】
: 输的莫名其妙
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c*a
10 楼
是的，做过的估计都会觉得10倍的增加太少了，尤其是用tnf刺激的。当然我不知道你
处理多长时间以后测的luciferase activity.
qPCR随便做几个well-characterized 下游基因就好了，比如TNFa, IL6, IkBa, IL8之
类的
另外，IkBa Western 和EMSA的结果都要比luciferase assay更可靠吧。
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s*n
11 楼
太正直的人
说的太多
社会不容
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f*d
12 楼
我做了几个时间点，2，4，8 小时的都是大概8－10倍的扩增，24小时之后降到了5倍。
主要是这个assay结果出不来，心里总觉得有什么不对。。。。。不过qPCR是个好主意

【在 c******a 的大作中提到】
: 是的，做过的估计都会觉得10倍的增加太少了，尤其是用tnf刺激的。当然我不知道你
: 处理多长时间以后测的luciferase activity.
: qPCR随便做几个well-characterized 下游基因就好了，比如TNFa, IL6, IkBa, IL8之
: 类的
: 另外，IkBa Western 和EMSA的结果都要比luciferase assay更可靠吧。
avatar
s*n
13 楼
而在三天后，他又连发两条微博，里面有几句意味深长的话：“我这个人就这一个优点
，就喜欢听别人教育我，然后把你们这些所谓的专业人士的意见当成屁放了”，“放眼
寰宇，吾只认李师一人，故劝尔等跳梁之辈少在我面前嘚瑟。”。这些话里都带着些不
屑和气愤，他应该是那些专业评审非常不满 ，而且是极度厌恶。
说的挺好
社会需要这样的人
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c*b
14 楼
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=7EDAC33E-3981-4E58-8A

biotin
treatment
EMSA

【在 f*******d 的大作中提到】
: 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
: 想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
: 了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
: labeled, 序列如下：AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
: 然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响，所以就在细胞系里面建立了
: luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候，用
: TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候，我的treatment
: 确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
: DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样，是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
: GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb，大家用 EMSA
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s*n
15 楼
他是在被淘汰之后说的

【在 x******h 的大作中提到】
:
: 从他发的微博来看，可能为人有点冲，恨不得在围脖里揭黑幕的主，这种搅屎棍任何圈
: 子都不敢接
avatar
x*h
17 楼

那么多被淘汰的，有人这样？

【在 s******n 的大作中提到】
: 他是在被淘汰之后说的
avatar
f*d
18 楼
有人来帮我看看这个序列嘛？会不会是DNA序列不对呢？
avatar
s*n
19 楼
但是没有这么黑的
太黑了
唱的明显强于对手，什么安琪，但是选票却反了过来


: 那么多被淘汰的，有人这样？



【在 x******h 的大作中提到】
:
: 那么多被淘汰的，有人这样？
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t*t
20 楼
序列看起来是经典NF-kB结合序列。
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I*s
21 楼
我还是更喜欢毛不易的
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f*d
22 楼
多谢！那为啥做EMSA的序列和做luciferase reporter的序列不一样呢～

【在 t****t 的大作中提到】
: 序列看起来是经典NF-kB结合序列。
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t*t
23 楼
核心序列有两三个位置不是那么保守
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