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又熟悉NfkB的大牛吗?EMSA和luciferase reporter的结果不一致,请教!
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f*d
2
小妹刚刚开始做NfkB pathway.
想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
labeled, 序列如下:AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响,所以就在细胞系里面建立了
luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候,用
TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候,我的treatment
确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样,是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb,大家用 EMSA
DNA 序列会跟这个reporter的DNA序列不一样呢?请牛人指导一下吧!
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S*s
4
我觉得你luciferase assay有问题。
一般TNF刺激, NF-KB luc reporter应该有100 fold左右的差别。
According to 某免疫大牛,<10 fold的他们认为太trivial
可以QPCR做几个下游的基因看看
另外如果真的觉得有变化,不妨做RNASeq or array.

biotin
treatment
EMSA

【在 f*******d 的大作中提到】
: 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
: 想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
: 了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
: labeled, 序列如下:AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
: 然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响,所以就在细胞系里面建立了
: luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候,用
: TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候,我的treatment
: 确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
: DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样,是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
: GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb,大家用 EMSA

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f*d
6
多谢! 但是他的下游基因太多了,不知道从哪几个入手,有必要买一个qPCR array 吗?

【在 S*********s 的大作中提到】
: 我觉得你luciferase assay有问题。
: 一般TNF刺激, NF-KB luc reporter应该有100 fold左右的差别。
: According to 某免疫大牛,<10 fold的他们认为太trivial
: 可以QPCR做几个下游的基因看看
: 另外如果真的觉得有变化,不妨做RNASeq or array.
:
: biotin
: treatment
: EMSA

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s*n
7
really good, repeating
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S*s
8
看看 David Baltimore的paper

biotin
treatment
EMSA

【在 f*******d 的大作中提到】
: 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
: 想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
: 了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
: labeled, 序列如下:AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
: 然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响,所以就在细胞系里面建立了
: luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候,用
: TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候,我的treatment
: 确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
: DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样,是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
: GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb,大家用 EMSA

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x*h
9

从他发的微博来看,可能为人有点冲,恨不得在围脖里揭黑幕的主,这种搅屎棍任何圈
子都不敢接

【在 W*******d 的大作中提到】
: 输的莫名其妙
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c*a
10
是的,做过的估计都会觉得10倍的增加太少了,尤其是用tnf刺激的。当然我不知道你
处理多长时间以后测的luciferase activity.
qPCR随便做几个well-characterized 下游基因就好了,比如TNFa, IL6, IkBa, IL8之
类的
另外,IkBa Western 和EMSA的结果都要比luciferase assay更可靠吧。
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s*n
11
太正直的人
说的太多
社会不容
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f*d
12
我做了几个时间点,2,4,8 小时的都是大概8-10倍的扩增,24小时之后降到了5倍。
主要是这个assay结果出不来,心里总觉得有什么不对。。。。。不过qPCR是个好主意

【在 c******a 的大作中提到】
: 是的,做过的估计都会觉得10倍的增加太少了,尤其是用tnf刺激的。当然我不知道你
: 处理多长时间以后测的luciferase activity.
: qPCR随便做几个well-characterized 下游基因就好了,比如TNFa, IL6, IkBa, IL8之
: 类的
: 另外,IkBa Western 和EMSA的结果都要比luciferase assay更可靠吧。

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s*n
13
而在三天后,他又连发两条微博,里面有几句意味深长的话:“我这个人就这一个优点
,就喜欢听别人教育我,然后把你们这些所谓的专业人士的意见当成屁放了”,“放眼
寰宇,吾只认李师一人,故劝尔等跳梁之辈少在我面前嘚瑟。”。这些话里都带着些不
屑和气愤,他应该是那些专业评审非常不满 ,而且是极度厌恶。
说的挺好
社会需要这样的人
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c*b
14
http://www.piercenet.com/browse.cfm?fldID=7EDAC33E-3981-4E58-8A

biotin
treatment
EMSA

【在 f*******d 的大作中提到】
: 小妹刚刚开始做NfkB pathway.
: 想研究一个treatment对细胞能不能激活这个pathway。我首先做了IkBa western, 看到
: 了降解。然后做了EMSA. 也看到了increased gel shift. EMSA用的probe是买的biotin
: labeled, 序列如下:AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC。
: 然后我想看看不同的基因超表达会不会对这个造成影响,所以就在细胞系里面建立了
: luciferase reporter system. 用的是买来的plasmid, pGL4.32. 作实验的时候,用
: TNFa做了positive control, 看到了大概10倍的信号。但是这个时候,我的treatment
: 确一点信号扩增都没有。 我后来查了一下pGL4.32厘米的nfkb reponse element, 发现
: DNA序列跟之前我做EMSA的序列不一样,是GGGAATTTCC GGGGACTTTCCGGGAATTCC
: GGGGACTTTCCGGGAATTTCC。 我就不知道该怎么办了。为什么同样的Nfkb,大家用 EMSA

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s*n
15
他是在被淘汰之后说的

【在 x******h 的大作中提到】
:
: 从他发的微博来看,可能为人有点冲,恨不得在围脖里揭黑幕的主,这种搅屎棍任何圈
: 子都不敢接

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x*h
17

那么多被淘汰的,有人这样?

【在 s******n 的大作中提到】
: 他是在被淘汰之后说的
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f*d
18
有人来帮我看看这个序列嘛?会不会是DNA序列不对呢?
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s*n
19
但是没有这么黑的
太黑了
唱的明显强于对手,什么安琪,但是选票却反了过来


: 那么多被淘汰的,有人这样?



【在 x******h 的大作中提到】
:
: 那么多被淘汰的,有人这样?

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t*t
20
序列看起来是经典NF-kB结合序列。
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I*s
21
我还是更喜欢毛不易的
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f*d
22
多谢!那为啥做EMSA的序列和做luciferase reporter的序列不一样呢~

【在 t****t 的大作中提到】
: 序列看起来是经典NF-kB结合序列。
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t*t
23
核心序列有两三个位置不是那么保守
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