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问几个关于转染的问题，请大家指教

问几个关于转染的问题，请大家指教# Biology - 生物学

z*r2011-05-18 07:05

1 楼

【以下文字转载自 EB23 讨论区】
发信人: zqmaster (battlefield), 信区: EB23
标题: h1b 6年延期问题
发信站: BBS 未名空间站 (Fri May 8 19:19:44 2015, 美东)
最近刚跳到新东家，绿卡办的特别慢，很可能在h1b过期365天前提交不了perm。今天公
司移民Hr说我在前公司批准的140也能用来延我的h1b,想问下hr 说的对吗？我知道ac21
有提到140可以用来延，不过不是一个雇主提交的140可以用吗？

k*a2011-05-18 07:05

2 楼

是有人想趁机牟利么？

b*82011-05-18 07:05

3 楼

如题，最近做dual luciferase reporter assay，主要是想看在癌细胞中敲除某一基因
A后，对另一基因B启动子活性的影响。（已经证实敲除A后能下调B的mRNA转录和翻译表
达）。我尝试过两种不同的转染顺序，如下：
1）24 well plate铺板，第二天转染A的siRNA,第三天转染B的启动子报告基因质粒，第
四天收细胞assay，发现siControl和siA的renilla的读数相差很大，有时能达到10倍左
右，出来的ratio也经常是千奇百怪，忽高忽低，难以解释，
2）考虑到可能是先转染siRNA会影响后续质粒的转染效率。于是换方案，先在6孔板中
铺板，第二天转染质粒，过夜后换液，转染24小时候胰酶消化，将细胞铺到24孔板中，
24小时后再分别转染siControl和siA，出来的结果漂亮多了，至少data不像前一种方案
那么难看了。
我想问一下，第二种方法是否合理，虽然两种方法我都在文献上看到过，但是私以为第
1中方案似乎更为合理，但是在我们的实验中，它对renilla的影响实在太大。
另外，想问一个lipofectamine2000的转染问题，以6孔板为例，mannual上建议的
volume of plating medium是2ml，volume of diluting medium 为250*2=500ul，那么
最后转染的培养基总体积到底应该是2ml，还是2.5ml，我一直是用2ml，可是经常发现
毒性太大，即使在质粒和lipo减半的情况下。今天师姐告诉我她一直用的是2.5ml，各
位，你们是怎么弄的，最近试验不顺利，弄得自己都怀疑自己的每一步是不是都有问题
了。
谢谢