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histone western blot 求教
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histone western blot 求教# Biology - 生物学
R*s
1 楼
【 以下文字转载自 astrology 讨论区 】
发信人: raccoon1201 (christine), 信区: astrology
标 题: 搞笑！《见与不见》改编
发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jan 7 12:12:25 2011, 美东)
加班勿扰》版：你病，或者不病倒，老板就在那里，不悲不喜； 你休，或者不休假，
工作就在那里，不来不去； 你拼，或者不拼命，工资就在那里，不增不减； 你辞，或
者不辞职，地球还是会转，不歇不停； 让我中500万，或者 让我傍个大款， 扯淡，蛋
疼，淡定，悲催！
《跳槽勿扰》版：你进，或不进四大，围城就在那里，不悲不喜；你出，或不出差，疲
惫就在那里，不来不去；你加，或不加班，工资就在那里，不增不减；你跳，或不跳槽
，公司就在这里，不舍不弃；来人人的怀里，或者，让KPI住进你的心里，漠然，淡定
，寂寞，欢喜。
《拆迁勿扰》版：你怕，或者不怕我，拆迁就在那里，不怠不慢。你躲，或者不躲我，
车轮就在那里，不缓不急；你听，或者不听我，彪汉就在那里，不善不慈；你服，或者
不服我，你的命就在我手里，不逃不离；来我怀里，或者，让我把你按进车轮里。默然
，存亡。寂静，欢喜。
【非熊勿扰2】：你爆，或者不爆我，G点就在那里，不疼不痒。你滴，或者不滴我，蜡
就在那里，不旺不灭。你用，或者不用我，油就在那里，不沸不冻。你给，或者不给我
，我的套就在你的兜里，不大不小，来我的家里，或者让我住进你们家里，默然。胀痛
。3P。炙热。抽动。欢喜… ——口味重！
《挂科勿扰》版：你看 或者不看书 分数就在那里 不增不减 你开 或者不开卷 态度就
在那里 不紧不慢 你挂 或者不挂科 命运就在那里 不悲不喜 让我背到考题 或者 让考
题住进我的心里 默然 淡定 寂静 欢喜 。。。。
《暴富勿扰版》：你加班或是不加班，工资就在这里，不高不低。你爱他或者不爱他，
婚姻就在这里，不离不弃。你买房或者不买房，价钱就在这里，不偏不倚。让我一夜暴
富，或者让毛大孙子娶我为妻。扯蛋，无语，做梦，苦逼。
《河蟹勿扰》版：你拆，或者不拆我，家就在那里，不买不卖。你焚，或者不焚我，人
就在那里，不生不死。你碾，或者不碾我，车就在那里，不来不去。你删，或者不删我
，我的帖就在你的视线里，不多不少。来我的国里，或者让我住进你们国里，默然，如
我。欢喜，如你。
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f*c
2 楼
没有任何条带, 5%-15% gradient gel, 0.22 um PVDF transfer 100 分钟，抗体也换
了，H3, H4都是没有任何条带，同一张膜别的blot没问题。
问题会出在哪里？一定要用acid extraction吗？
谢谢
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R*o
3 楼
三俗

【在 R**********s 的大作中提到】
: 【 以下文字转载自 astrology 讨论区 】
: 发信人: raccoon1201 (christine), 信区: astrology
: 标 题: 搞笑！《见与不见》改编
: 发信站: BBS 未名空间站 (Fri Jan 7 12:12:25 2011, 美东)
: 加班勿扰》版：你病，或者不病倒，老板就在那里，不悲不喜； 你休，或者不休假，
: 工作就在那里，不来不去； 你拼，或者不拼命，工资就在那里，不增不减； 你辞，或
: 者不辞职，地球还是会转，不歇不停； 让我中500万，或者 让我傍个大款， 扯淡，蛋
: 疼，淡定，悲催！
: 《跳槽勿扰》版：你进，或不进四大，围城就在那里，不悲不喜；你出，或不出差，疲
: 惫就在那里，不来不去；你加，或不加班，工资就在那里，不增不减；你跳，或不跳槽
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s*s
4 楼
人家说了acid，你就老老实实吧做buffer和胶吧。
我好像记得以前用普通的方法也做过，貌似能做出来，不过比较难看。
不是100%确定。

【在 f*c 的大作中提到】
: 没有任何条带, 5%-15% gradient gel, 0.22 um PVDF transfer 100 分钟，抗体也换
: 了，H3, H4都是没有任何条带，同一张膜别的blot没问题。
: 问题会出在哪里？一定要用acid extraction吗？
: 谢谢
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R*s
5 楼
人民群众喜闻乐见啊

【在 R*****o 的大作中提到】
: 三俗
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f*c
6 楼
人家没说要用acid,我是自己搜，看有人说用acid.

【在 s******s 的大作中提到】
: 人家说了acid，你就老老实实吧做buffer和胶吧。
: 我好像记得以前用普通的方法也做过，貌似能做出来，不过比较难看。
: 不是100%确定。
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R*o
7 楼
属实

【在 R**********s 的大作中提到】
: 人民群众喜闻乐见啊
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s*s
8 楼
对呀。那个带正电荷，标准都是acid extract，然后跑urea的胶

【在 f*c 的大作中提到】
: 人家没说要用acid,我是自己搜，看有人说用acid.
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c*e
9 楼
人民都三俗？

【在 R*****o 的大作中提到】
: 属实
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A*y
10 楼
You don't need acid extraction (do sonicate). I did over 100+ gel on HH3.
It is probably your antibody, the Abcam one (ab1791) is 1/10,000 dilution
against human
HH3.
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r*r
11 楼
interesting

【在 R**********s 的大作中提到】
: 人民群众喜闻乐见啊
avatar
c*b
12 楼
No need, but I did nuclei enrichment first

【在 s******s 的大作中提到】
: 对呀。那个带正电荷，标准都是acid extract，然后跑urea的胶
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R*s
13 楼
为啥你不是斑竹呢?

【在 r********r 的大作中提到】
: interesting
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f*c
14 楼
请问你用什么sample buffer? 还有gel running buffer, transfer buffer 有啥特别
的吗
我用abcam另外一个抗体ab18521，好像会弱一些



【在 A******y 的大作中提到】
: You don't need acid extraction (do sonicate). I did over 100+ gel on HH3.
: It is probably your antibody, the Abcam one (ab1791) is 1/10,000 dilution
: against human
: HH3.
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f*c
15 楼
我做了whole cell lysate,也做了nuclear lysate (相当于nuclei enrichment吧），
都没有，我甚至用了histones from calf thymus，都没有带，诡异阿

【在 c********b 的大作中提到】
: No need, but I did nuclei enrichment first
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A*y
16 楼
I use standard in-vitrogen NuPage gel, MES running buffer,transfer buffer at
20% methanol. It is your antibody, I'm also 99% sure.

【在 f*c 的大作中提到】
: 请问你用什么sample buffer? 还有gel running buffer, transfer buffer 有啥特别
: 的吗
: 我用abcam另外一个抗体ab18521，好像会弱一些
:
:
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s*r
17 楼
原来histone跑胶还要特别处理啊，长见识了...怪不得前一阵做nuclear
fractionation想用histone做内参，怎么搞都搞不出来。。
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p*i
18 楼
肯定是抗体的问题，H3在total lysates里很容易检测到。转膜完了，pon.s 染色都能
看到那四条带。
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f*d
19 楼
我做过无数的histoneH3, 我们把它当内参，因为小，又特别的好做。每次转膜之后，
把下面的减下来，就可以了。我们western 条件就是最最standard的。每次信号都特别
强。你肯定是没有sonicate你的lysate。
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m*e
20 楼
我直接用loading buffer加到六孔板里,然后煮样,上20ug左右的蛋白,跑最普通的胶,
HH3的条带非常亮啊,用的是cell signaling的抗体. 感觉这个蛋白丰度很高.

【在 f*c 的大作中提到】
: 没有任何条带, 5%-15% gradient gel, 0.22 um PVDF transfer 100 分钟，抗体也换
: 了，H3, H4都是没有任何条带，同一张膜别的blot没问题。
: 问题会出在哪里？一定要用acid extraction吗？
: 谢谢
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t*t
21 楼
I endorse this message.

【在 m*******e 的大作中提到】
: 我直接用loading buffer加到六孔板里,然后煮样,上20ug左右的蛋白,跑最普通的胶,
: HH3的条带非常亮啊,用的是cell signaling的抗体. 感觉这个蛋白丰度很高.
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f*c
22 楼
有没有sonicate?

【在 m*******e 的大作中提到】
: 我直接用loading buffer加到六孔板里,然后煮样,上20ug左右的蛋白,跑最普通的胶,
: HH3的条带非常亮啊,用的是cell signaling的抗体. 感觉这个蛋白丰度很高.
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d*i
23 楼
我估计是没有把histone从细胞核里面释放出来。我做过whole cell lysate和nuclear
的，都很好做，就是普通的gel。抗体估计不是问题。
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m*e
24 楼
No

【在 f*c 的大作中提到】
: 有没有sonicate?
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A*y
25 楼
There are some horrible HH3 antibody...trust me...almost ten year experience.

nuclear

【在 d****i 的大作中提到】
: 我估计是没有把histone从细胞核里面释放出来。我做过whole cell lysate和nuclear
: 的，都很好做，就是普通的gel。抗体估计不是问题。
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B*H
26 楼
楼主，你就不能不跑胶，先做个DOT BLOT看看是不是抗体的问题。ACTIVMOTIF也有好多
HISTONE的抗体可以试试。我用他们家H3的挺好的。
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a*a
27 楼
不用，直接细胞裂解煮10分钟去上样
我的条件是.45nc膜300毫安45分钟
做了6年组蛋白修饰的爬过
要是用ripa extract估计是拿不到

【在 f*c 的大作中提到】
: 没有任何条带, 5%-15% gradient gel, 0.22 um PVDF transfer 100 分钟，抗体也换
: 了，H3, H4都是没有任何条带，同一张膜别的blot没问题。
: 问题会出在哪里？一定要用acid extraction吗？
: 谢谢
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f*c
28 楼
做出来了，把transfer 电压时间都下降了。
谢谢大家
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d*i
29 楼
估计是histone穿膜而过了。。。。。
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t*y
30 楼
这也很奇怪。一直和楼主一样转的。永远有带。而且丽春红染色就看的到。
除非有两种可能就是1 楼主用某些商业化的裂解液，太温和了，核根本没有破。
另外就是 转膜的时候没有转上17kd的带。
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s*x
31 楼
exact conditions???

【在 f*c 的大作中提到】
: 做出来了，把transfer 电压时间都下降了。
: 谢谢大家
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f*c
32 楼
也不能说exactly the same condition, 把样品狠狠地vortex 了几次，transfer电压
下降了，只前用的电压都比较高，然后transfer buffer里去掉了SDS （我们之前
transfer buffer is same as running buffer）,最后反正是whole cell lysate有带
了，信号还挺强，到底是哪个起了作用也不知道。

【在 s**x 的大作中提到】
: exact conditions???
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l*1
33 楼
把样品狠狠地vortex 了几次
RE: 到底是哪个起了作用也不知道
发信人: dahuzi (huhuhu), 信区: Biology
标 题: Re: histone western blot 求教
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Aug 19 10:06:12 2013, 美东)
我估计是没有把histone从细胞核里面释放出来。bla bla ba

【在 f*c 的大作中提到】
: 也不能说exactly the same condition, 把样品狠狠地vortex 了几次，transfer电压
: 下降了，只前用的电压都比较高，然后transfer buffer里去掉了SDS （我们之前
: transfer buffer is same as running buffer）,最后反正是whole cell lysate有带
: 了，信号还挺强，到底是哪个起了作用也不知道。
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a*a
34 楼
sds

【在 f*c 的大作中提到】
: 也不能说exactly the same condition, 把样品狠狠地vortex 了几次，transfer电压
: 下降了，只前用的电压都比较高，然后transfer buffer里去掉了SDS （我们之前
: transfer buffer is same as running buffer）,最后反正是whole cell lysate有带
: 了，信号还挺强，到底是哪个起了作用也不知道。
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s*g
35 楼
俺也用cell signaling的histone 抗体,还行啊

【在 m*******e 的大作中提到】
: 我直接用loading buffer加到六孔板里,然后煮样,上20ug左右的蛋白,跑最普通的胶,
: HH3的条带非常亮啊,用的是cell signaling的抗体. 感觉这个蛋白丰度很高.
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