诡异的PCR结果,10个包子求教# Biology - 生物学
d*i
1 楼
3T外置backup，
保修期一年刚过，
就四十多个坏道了。
修都没法修。
5年前1T的还跑得杠杠的。
以后任他deal满天飞，
也再也不买海门这烂货了。
保修期一年刚过，
就四十多个坏道了。
修都没法修。
5年前1T的还跑得杠杠的。
以后任他deal满天飞，
也再也不买海门这烂货了。
v*a
2 楼
请见附图：
1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
重新设计了primer也仍旧如此。
请高手赐教。。。
1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
重新设计了primer也仍旧如此。
请高手赐教。。。
w*u
3 楼
从来只买WD
y*s
4 楼
PCR效率问题。
1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
2. 以PC样品11为模板，做个annealing的gradient，选个最合适的温度，可适当增加
cycle数。
3. 换一对primer，目的扩增片段稍短一些，避开难扩增区域。
4. PCR样品在4度assembly。
5. 换个针对性的polymerase。
这5个都试一下，试不出来才怪。
silencing.
认。
【在 v***a 的大作中提到】
: 请见附图：
: 1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
: 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
: 做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
: S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
: 重新设计了primer也仍旧如此。
: 请高手赐教。。。
1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
2. 以PC样品11为模板，做个annealing的gradient，选个最合适的温度，可适当增加
cycle数。
3. 换一对primer，目的扩增片段稍短一些，避开难扩增区域。
4. PCR样品在4度assembly。
5. 换个针对性的polymerase。
这5个都试一下，试不出来才怪。
silencing.
认。
【在 v***a 的大作中提到】
: 请见附图：
: 1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
: 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
: 做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
: S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
: 重新设计了primer也仍旧如此。
: 请高手赐教。。。
M*y
5 楼
内置的，4块里刚连续坏了2块。还在质保内。
【在 d******i 的大作中提到】
: 3T外置backup，
: 保修期一年刚过，
: 就四十多个坏道了。
: 修都没法修。
: 5年前1T的还跑得杠杠的。
: 以后任他deal满天飞，
: 也再也不买海门这烂货了。
【在 d******i 的大作中提到】
: 3T外置backup，
: 保修期一年刚过，
: 就四十多个坏道了。
: 修都没法修。
: 5年前1T的还跑得杠杠的。
: 以后任他deal满天飞，
: 也再也不买海门这烂货了。
v*a
6 楼
谢谢。1、5没试过。
问题是我的这些sample基本都是duplicate dish，细胞情况类似，为什么有的target
gene可以扩增到，而有的完全不可以呢？
包子已发。
【在 y******s 的大作中提到】
: PCR效率问题。
: 1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
: 2. 以PC样品11为模板，做个annealing的gradient，选个最合适的温度，可适当增加
: cycle数。
: 3. 换一对primer，目的扩增片段稍短一些，避开难扩增区域。
: 4. PCR样品在4度assembly。
: 5. 换个针对性的polymerase。
: 这5个都试一下，试不出来才怪。
:
: silencing.
问题是我的这些sample基本都是duplicate dish，细胞情况类似，为什么有的target
gene可以扩增到，而有的完全不可以呢？
包子已发。
【在 y******s 的大作中提到】
: PCR效率问题。
: 1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
: 2. 以PC样品11为模板，做个annealing的gradient，选个最合适的温度，可适当增加
: cycle数。
: 3. 换一对primer，目的扩增片段稍短一些，避开难扩增区域。
: 4. PCR样品在4度assembly。
: 5. 换个针对性的polymerase。
: 这5个都试一下，试不出来才怪。
:
: silencing.
d*i
7 楼
都是做硬盘的，
为啥海门的质量这么差呢？
没有QC吗？
为啥海门的质量这么差呢？
没有QC吗？
y*s
8 楼
如果GC Rich （>60%）的话试1应该就可以了 （try gradient or 3% DMSO）。
样品制备不均一等原因，总会有系统误差。
另外奇怪的是，如果检测RNAi的效率，用Q-PCR啊，半定量太落伍了，你的control如果
是饱和了，根本反映不了你上样量的差别。
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢。1、5没试过。
: 问题是我的这些sample基本都是duplicate dish，细胞情况类似，为什么有的target
: gene可以扩增到，而有的完全不可以呢？
: 包子已发。
样品制备不均一等原因，总会有系统误差。
另外奇怪的是，如果检测RNAi的效率，用Q-PCR啊，半定量太落伍了，你的control如果
是饱和了，根本反映不了你上样量的差别。
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢。1、5没试过。
: 问题是我的这些sample基本都是duplicate dish，细胞情况类似，为什么有的target
: gene可以扩增到，而有的完全不可以呢？
: 包子已发。
J*i
9 楼
人家叫希捷。。。
v*a
10 楼
谢谢你，回头试试1. 打算这个做出来了就上qPCR……现在只求确实有KD就行。
【在 y******s 的大作中提到】
: 如果GC Rich （>60%）的话试1应该就可以了 （try gradient or 3% DMSO）。
: 样品制备不均一等原因，总会有系统误差。
: 另外奇怪的是，如果检测RNAi的效率，用Q-PCR啊，半定量太落伍了，你的control如果
: 是饱和了，根本反映不了你上样量的差别。
【在 y******s 的大作中提到】
: 如果GC Rich （>60%）的话试1应该就可以了 （try gradient or 3% DMSO）。
: 样品制备不均一等原因，总会有系统误差。
: 另外奇怪的是，如果检测RNAi的效率，用Q-PCR啊，半定量太落伍了，你的control如果
: 是饱和了，根本反映不了你上样量的差别。
C*7
11 楼
前两天刚看个新闻，HGST可靠性更好点
【在 d******i 的大作中提到】
: 都是做硬盘的，
: 为啥海门的质量这么差呢？
: 没有QC吗？
【在 d******i 的大作中提到】
: 都是做硬盘的，
: 为啥海门的质量这么差呢？
: 没有QC吗？
l*y
12 楼
直接western吧，反正KD光测个RNA也没啥意义
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢你，回头试试1. 打算这个做出来了就上qPCR……现在只求确实有KD就行。
【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢你，回头试试1. 打算这个做出来了就上qPCR……现在只求确实有KD就行。
d*i
13 楼
call cs赶紧换。
自己出过去的运费，
给你的replacement还是recertified的。
所以cross finger吧。
以后离他家远点儿。
【在 M********y 的大作中提到】
: 内置的，4块里刚连续坏了2块。还在质保内。
自己出过去的运费，
给你的replacement还是recertified的。
所以cross finger吧。
以后离他家远点儿。
【在 M********y 的大作中提到】
: 内置的，4块里刚连续坏了2块。还在质保内。
C*S
14 楼
"设计的引物跨越了好几个intron和extron区间"
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
设计的PCR产物估计太长了，扩增效率很低的。
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
设计的PCR产物估计太长了，扩增效率很低的。
M*y
15 楼
是啊，自己出了运费，换了一块2008年造的recertified，一
块2014年造的新的。希望不要继续悲摧，还有2块一起买的
在高危中。
【在 d******i 的大作中提到】
: call cs赶紧换。
: 自己出过去的运费，
: 给你的replacement还是recertified的。
: 所以cross finger吧。
: 以后离他家远点儿。
块2014年造的新的。希望不要继续悲摧，还有2块一起买的
在高危中。
【在 d******i 的大作中提到】
: call cs赶紧换。
: 自己出过去的运费，
: 给你的replacement还是recertified的。
: 所以cross finger吧。
: 以后离他家远点儿。
v*a
16 楼
找不到好的特异性高的抗体，WB出来都没有变化。所以用RNA看。痛苦。
【在 l***y 的大作中提到】
: 直接western吧，反正KD光测个RNA也没啥意义
【在 l***y 的大作中提到】
: 直接western吧，反正KD光测个RNA也没啥意义
d*i
17 楼
尼玛2008年recertify的，
这帮人好意思啊。
我的还在路上，看到手哥啥货色吧。
反正不能放重要数据了。
珍惜生命，远离海门。
【在 M********y 的大作中提到】
: 是啊，自己出了运费，换了一块2008年造的recertified，一
: 块2014年造的新的。希望不要继续悲摧，还有2块一起买的
: 在高危中。
这帮人好意思啊。
我的还在路上，看到手哥啥货色吧。
反正不能放重要数据了。
珍惜生命，远离海门。
【在 M********y 的大作中提到】
: 是啊，自己出了运费，换了一块2008年造的recertified，一
: 块2014年造的新的。希望不要继续悲摧，还有2块一起买的
: 在高危中。
v*a
18 楼
现在这个产物是300多bp的，应该还好？
【在 C**S 的大作中提到】
: "设计的引物跨越了好几个intron和extron区间"
: －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
: 设计的PCR产物估计太长了，扩增效率很低的。
【在 C**S 的大作中提到】
: "设计的引物跨越了好几个intron和extron区间"
: －－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
: 设计的PCR产物估计太长了，扩增效率很低的。
b*r
19 楼
也许引物问题，根本不是扩的你想要的东西。测序证实一下先再往下做吧
d*i
20 楼
能不能再短点看看。300对我来说心里不塌实的。。
【在 v***a 的大作中提到】
: 现在这个产物是300多bp的，应该还好？
m*o
21 楼
大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron
,统统处理一下,没坏处.
,统统处理一下,没坏处.
g*9
22 楼
有些RNA的确copy很低的，虽然蛋白看着还成。
silencing.
认。
【在 v***a 的大作中提到】
: 请见附图：
: 1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
: 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
: 做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
: S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
: 重新设计了primer也仍旧如此。
: 请高手赐教。。。
silencing.
认。
【在 v***a 的大作中提到】
: 请见附图：
: 1-3为同一批次收的细胞，4-11为另一批次的。
: 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间，故未用DNase I处理RNA。
: 做的是siRNA gene knockdown实验，其中1、4、11是Ctrl，其余为目标gene silencing.
: S16扩增出来都还可以，同时扩增目标gene，结果就不行了。Ctrl（4、11）都很难辨认。
: 重新设计了primer也仍旧如此。
: 请高手赐教。。。
v*a
23 楼
多谢。打算以后都要用Dnase处理。
intron
【在 m***o 的大作中提到】
: 大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron
: ,统统处理一下,没坏处.
intron
【在 m***o 的大作中提到】
: 大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron
: ,统统处理一下,没坏处.
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