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诡异的PCR结果,10个包子求教
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诡异的PCR结果,10个包子求教# Biology - 生物学
d*i
1
3T外置backup,
保修期一年刚过,
就四十多个坏道了。
修都没法修。
5年前1T的还跑得杠杠的。
以后任他deal满天飞,
也再也不买海门这烂货了。
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v*a
2
请见附图:
1-3为同一批次收的细胞,4-11为另一批次的。
考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间,故未用DNase I处理RNA。
做的是siRNA gene knockdown实验,其中1、4、11是Ctrl,其余为目标gene silencing.
S16扩增出来都还可以,同时扩增目标gene,结果就不行了。Ctrl(4、11)都很难辨认。
重新设计了primer也仍旧如此。
请高手赐教。。。
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w*u
3
从来只买WD
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y*s
4
PCR效率问题。
1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
2. 以PC样品11为模板,做个annealing的gradient,选个最合适的温度,可适当增加
cycle数。
3. 换一对primer,目的扩增片段稍短一些,避开难扩增区域。
4. PCR样品在4度assembly。
5. 换个针对性的polymerase。
这5个都试一下,试不出来才怪。

silencing.
认。

【在 v***a 的大作中提到】
: 请见附图:
: 1-3为同一批次收的细胞,4-11为另一批次的。
: 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间,故未用DNase I处理RNA。
: 做的是siRNA gene knockdown实验,其中1、4、11是Ctrl,其余为目标gene silencing.
: S16扩增出来都还可以,同时扩增目标gene,结果就不行了。Ctrl(4、11)都很难辨认。
: 重新设计了primer也仍旧如此。
: 请高手赐教。。。

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M*y
5
内置的,4块里刚连续坏了2块。还在质保内。

【在 d******i 的大作中提到】
: 3T外置backup,
: 保修期一年刚过,
: 就四十多个坏道了。
: 修都没法修。
: 5年前1T的还跑得杠杠的。
: 以后任他deal满天飞,
: 也再也不买海门这烂货了。

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v*a
6
谢谢。1、5没试过。
问题是我的这些sample基本都是duplicate dish,细胞情况类似,为什么有的target
gene可以扩增到,而有的完全不可以呢?
包子已发。

【在 y******s 的大作中提到】
: PCR效率问题。
: 1. 目标DNA GC rich的加DMSO试试。
: 2. 以PC样品11为模板,做个annealing的gradient,选个最合适的温度,可适当增加
: cycle数。
: 3. 换一对primer,目的扩增片段稍短一些,避开难扩增区域。
: 4. PCR样品在4度assembly。
: 5. 换个针对性的polymerase。
: 这5个都试一下,试不出来才怪。
:
: silencing.

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d*i
7
都是做硬盘的,
为啥海门的质量这么差呢?
没有QC吗?
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y*s
8
如果GC Rich (>60%)的话试1应该就可以了 (try gradient or 3% DMSO)。
样品制备不均一等原因,总会有系统误差。
另外奇怪的是,如果检测RNAi的效率,用Q-PCR啊,半定量太落伍了,你的control如果
是饱和了,根本反映不了你上样量的差别。

【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢。1、5没试过。
: 问题是我的这些sample基本都是duplicate dish,细胞情况类似,为什么有的target
: gene可以扩增到,而有的完全不可以呢?
: 包子已发。

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J*i
9
人家叫希捷。。。
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v*a
10
谢谢你,回头试试1. 打算这个做出来了就上qPCR……现在只求确实有KD就行。

【在 y******s 的大作中提到】
: 如果GC Rich (>60%)的话试1应该就可以了 (try gradient or 3% DMSO)。
: 样品制备不均一等原因,总会有系统误差。
: 另外奇怪的是,如果检测RNAi的效率,用Q-PCR啊,半定量太落伍了,你的control如果
: 是饱和了,根本反映不了你上样量的差别。

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C*7
11
前两天刚看个新闻,HGST可靠性更好点

【在 d******i 的大作中提到】
: 都是做硬盘的,
: 为啥海门的质量这么差呢?
: 没有QC吗?

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l*y
12
直接western吧,反正KD光测个RNA也没啥意义

【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢你,回头试试1. 打算这个做出来了就上qPCR……现在只求确实有KD就行。
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d*i
13
call cs赶紧换。
自己出过去的运费,
给你的replacement还是recertified的。
所以cross finger吧。
以后离他家远点儿。

【在 M********y 的大作中提到】
: 内置的,4块里刚连续坏了2块。还在质保内。
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C*S
14
"设计的引物跨越了好几个intron和extron区间"
-----------------------
设计的PCR产物估计太长了,扩增效率很低的。
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M*y
15
是啊,自己出了运费,换了一块2008年造的recertified,一
块2014年造的新的。希望不要继续悲摧,还有2块一起买的
在高危中。

【在 d******i 的大作中提到】
: call cs赶紧换。
: 自己出过去的运费,
: 给你的replacement还是recertified的。
: 所以cross finger吧。
: 以后离他家远点儿。

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v*a
16
找不到好的特异性高的抗体,WB出来都没有变化。所以用RNA看。痛苦。

【在 l***y 的大作中提到】
: 直接western吧,反正KD光测个RNA也没啥意义
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d*i
17
尼玛2008年recertify的,
这帮人好意思啊。
我的还在路上,看到手哥啥货色吧。
反正不能放重要数据了。
珍惜生命,远离海门。

【在 M********y 的大作中提到】
: 是啊,自己出了运费,换了一块2008年造的recertified,一
: 块2014年造的新的。希望不要继续悲摧,还有2块一起买的
: 在高危中。

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v*a
18
现在这个产物是300多bp的,应该还好?

【在 C**S 的大作中提到】
: "设计的引物跨越了好几个intron和extron区间"
: -----------------------
: 设计的PCR产物估计太长了,扩增效率很低的。

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b*r
19
也许引物问题,根本不是扩的你想要的东西。测序证实一下先再往下做吧
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d*i
20

能不能再短点看看。300对我来说心里不塌实的。。

【在 v***a 的大作中提到】
: 现在这个产物是300多bp的,应该还好?
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m*o
21
大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron
,统统处理一下,没坏处.
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g*9
22
有些RNA的确copy很低的,虽然蛋白看着还成。

silencing.
认。

【在 v***a 的大作中提到】
: 请见附图:
: 1-3为同一批次收的细胞,4-11为另一批次的。
: 考虑到设计的引物跨越了好几个intron和extron区间,故未用DNase I处理RNA。
: 做的是siRNA gene knockdown实验,其中1、4、11是Ctrl,其余为目标gene silencing.
: S16扩增出来都还可以,同时扩增目标gene,结果就不行了。Ctrl(4、11)都很难辨认。
: 重新设计了primer也仍旧如此。
: 请高手赐教。。。

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v*a
23
多谢。打算以后都要用Dnase处理。

intron

【在 m***o 的大作中提到】
: 大家都不用DNAse处理吗?有DNA也会影响你的PCR 效率.而且不要相信什么跨几个intron
: ,统统处理一下,没坏处.

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