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RT-PCR 疑问

RT-PCR 疑问# Biology - 生物学

z*92014-01-12 08:01

1 楼

我一做RT－PCR就头疼，我是作病原体感染的，经常需要从组织样本中分离RNA，再通过
RT－PCR扩增出病原体（主要是病毒）的目的基因，这个目的基因也不是很长，基本3Kb
以下，我是用invitrogen的Reverse Transcriptase III,然后再作PCR，
每次我试图一次扩增出全长基因的时候，90％是没有扩增产物的，但是如果我分成若干
小片段，<1Kb，通常都有扩增产物。但是当病原体是RNA病毒时，基因内部突变很多，
这样作就会产生人为的误差，
我认为这主要是原样品的intact RNA量很低，请问各位有没有好的建议？谢谢！！

T*u2014-01-12 08:01

2 楼

你用的是random primer还是polyT做的RT

3Kb

【在 z*******9 的大作中提到】

: 我一做RT－PCR就头疼，我是作病原体感染的，经常需要从组织样本中分离RNA，再通过
: RT－PCR扩增出病原体（主要是病毒）的目的基因，这个目的基因也不是很长，基本3Kb
: 以下，我是用invitrogen的Reverse Transcriptase III,然后再作PCR，
: 每次我试图一次扩增出全长基因的时候，90％是没有扩增产物的，但是如果我分成若干
: 小片段，<1Kb，通常都有扩增产物。但是当病原体是RNA病毒时，基因内部突变很多，
: 这样作就会产生人为的误差，
: 我认为这主要是原样品的intact RNA量很低，请问各位有没有好的建议？谢谢！！

g*n2014-01-12 08:01

3 楼

你只是检测那个病毒基因，没有必要测全长。小片段好测就用小片段。我不明白为什么
测全长就能避免突变带来的影响。我看有两个途径来解决这个问题。1。选择突变频率
低的区段设计引物（如果文献中报道有这样的区段的话）。2。PCR 2－3段。如果有一
段因突变而消失，另外两段可以用来表示。
如果你要看那个基因的序列，那就是完全不同的问题了。

n*e2014-01-12 08:01

4 楼

elongation 时间够不够

z*92014-01-12 08:01

5 楼

谢谢各位，
我用的是Random Primer作RT。
扩增全长基因，正是我需要检测到特定条件下的不同组织中的病毒基因的突变的差异，
按理讲我可以用DeepSeq，不过小实验室不太富裕，而且就三四个基因，本身也不太需
要，
我RT的elongation 时间一般是90分钟，
会不会是SuperIII的效率要比SuperII差些？
我本意是想问问各位，有没有什么trick可以更高效的RT扩增出特别稀少的模板，
谢谢，

z*92014-01-12 08:01

6 楼

忘了讲，我一般是用Trizol提取RNA，

e*e2014-01-12 08:01

7 楼

做qRT-PCR不需要全场cDNA啊，用radom 9mers 做反转录，各个位置的模板就都会有了
，如果你的模板mRNA是poly A RNA,试着纯化一下poly A RNA，效率会高很多

【在 z*******9 的大作中提到】

: 谢谢各位，
: 我用的是Random Primer作RT。
: 扩增全长基因，正是我需要检测到特定条件下的不同组织中的病毒基因的突变的差异，
: 按理讲我可以用DeepSeq，不过小实验室不太富裕，而且就三四个基因，本身也不太需
: 要，
: 我RT的elongation 时间一般是90分钟，
: 会不会是SuperIII的效率要比SuperII差些？
: 我本意是想问问各位，有没有什么trick可以更高效的RT扩增出特别稀少的模板，
: 谢谢，

l*e2014-01-12 08:01

8 楼

目测是PCR问题。first-strand synthesis没问题。
1)试多几对引物
2)用68度延伸，不用72度。
3)用这个pcr kit:
http://www.qiagen.com/products/catalog/assay-technologies/end-p

【在 z*******9 的大作中提到】

z*92014-01-12 08:01

9 楼

我目的不是qRT－PCR，还是为了把全长gene都扩增出来，我用过Radomhexmer,不知这个
radom 9mers的效率会不会高些，
谢谢

【在 e**e 的大作中提到】

: 做qRT-PCR不需要全场cDNA啊，用radom 9mers 做反转录，各个位置的模板就都会有了
: ，如果你的模板mRNA是poly A RNA,试着纯化一下poly A RNA，效率会高很多

z*92014-01-12 08:01

10 楼

忘了提，我的PCR反应是用
NEB Fusion
他的效率是不是要差些？
谢谢，

【在 l********e 的大作中提到】

: 目测是PCR问题。first-strand synthesis没问题。
: 1)试多几对引物
: 2)用68度延伸，不用72度。
: 3)用这个pcr kit:
: http://www.qiagen.com/products/catalog/assay-technologies/end-p

g*n2014-01-12 08:01

11 楼

你用Randomhexmer做RT,怎么指望PCR出全长来。Random 是啥意思？