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请教克隆PCR-check不出目的gene的原因
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请教克隆PCR-check不出目的gene的原因# Biology - 生物学
r*f
1
最近炒股,做长线。所以看什么都喜欢看远。
什么特长能让小孩长大了最容易生存?就是说20-50年以后,什么样的人最吃香?
我觉得所有需要“创造力”不容易被电脑取代的行业都会有很高的工资。所以creative
最重要。
理由:
现在什么都有被电脑取代的趋向,以后更会是如此。什么不能被电脑取代,人的创造性
。以后什么会变便宜?制造业的东西变便宜。什么变贵?艺术品,比如好的电影,画画
,富有创造性的新产品等等。
从这点说,中国在未来的竞争力不会变强(因为中国式教育很难培养有创造力的人才)
,中国只会COPY。而未来COPY是最CHEAP的工作,因为它可以被电脑替代。
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c*n
2
想和我妈一起签证,不知道可行么?
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v*y
3
谍战, 还 算紧凑, 无脑的看还不错。 推荐。
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v*a
4
前几次一直长不出colony,换了一个ligase,这次transformation后平板上长得满满趴
趴。同时也用了一个uncut的vector做+ve ctrl,长得比有insert的还要满。
很高兴。挑了18个colony做PCR check,结果出来傻眼了,什么都没有,光marker那一
条lane亮的。大家觉得这是怎么回事啊?多谢多谢!
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x*a
5
我是做电脑的,举双手赞成你。
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s*y
6
搭车问一下同样地问题。
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m*z
8
how about your negative control?

【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次一直长不出colony,换了一个ligase,这次transformation后平板上长得满满趴
: 趴。同时也用了一个uncut的vector做+ve ctrl,长得比有insert的还要满。
: 很高兴。挑了18个colony做PCR check,结果出来傻眼了,什么都没有,光marker那一
: 条lane亮的。大家觉得这是怎么回事啊?多谢多谢!

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l*e
9
在我看来,孩子就是一个整体,各方面的发展是相辅相成的。所以很难界定什么最重要
,什么不太重要。
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s*y
10
我11年的时候就是和我妈一起签的。我签H1B,她签B2。

【在 c***n 的大作中提到】
: 想和我妈一起签证,不知道可行么?
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v*a
11
前几次没有长出colony,所以没有设-ve ctrl。。。

【在 m**z 的大作中提到】
: how about your negative control?
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c*t
12
时代变了,创造力会越来越重要。我们小时候大人灌输的是,学好数理化,走遍天下都
不怕。我们已经过时了

creative

【在 r****f 的大作中提到】
: 最近炒股,做长线。所以看什么都喜欢看远。
: 什么特长能让小孩长大了最容易生存?就是说20-50年以后,什么样的人最吃香?
: 我觉得所有需要“创造力”不容易被电脑取代的行业都会有很高的工资。所以creative
: 最重要。
: 理由:
: 现在什么都有被电脑取代的趋向,以后更会是如此。什么不能被电脑取代,人的创造性
: 。以后什么会变便宜?制造业的东西变便宜。什么变贵?艺术品,比如好的电影,画画
: ,富有创造性的新产品等等。
: 从这点说,中国在未来的竞争力不会变强(因为中国式教育很难培养有创造力的人才)
: ,中国只会COPY。而未来COPY是最CHEAP的工作,因为它可以被电脑替代。

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s*y
13
有什么要注意 或者特别的地方吗??

【在 s******y 的大作中提到】
: 我11年的时候就是和我妈一起签的。我签H1B,她签B2。
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m*z
14
我总觉得ligation plate上面长得太满不见得是好事。。。

【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次没有长出colony,所以没有设-ve ctrl。。。
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S*s
15
据说都可以,只是预约时间两者available时间可能不一样,你选重叠的时间预约到一
块就行(所以available的时间就会少点了,要早点预约以防约不到合适时间),另外
不需要把两者建立为同行人。
唯一例外是某个领事馆有段时间装修,H1b和B2分开在两个地方签证,那么你无论如何
都携签不了。

【在 c***n 的大作中提到】
: 想和我妈一起签证,不知道可行么?
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v*a
16
是啊,满得不得了,感觉就是成千上万个
都试了2个月了,一直clone不出来

【在 m**z 的大作中提到】
: 我总觉得ligation plate上面长得太满不见得是好事。。。
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n*w
17
试试用restriction enzyme来check你有没有插入目的片断。
找一个vector上和你目的片断里都有的一个酶,然后切看看。
有可能你载体自连了。试试dephosphorylation.
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T*t
18
不做negative control,就很难troubleshoot啊。再做一次吧,做实验经常是这样,做
十次control都没问题,一次偷懒不做就出问题了。所以还是不要怕麻烦,尽量把该做
的control都做上。

【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次没有长出colony,所以没有设-ve ctrl。。。
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v*a
19
谢谢!

【在 n***w 的大作中提到】
: 试试用restriction enzyme来check你有没有插入目的片断。
: 找一个vector上和你目的片断里都有的一个酶,然后切看看。
: 有可能你载体自连了。试试dephosphorylation.

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v*a
20
多谢了!刚才查了一下,说colony长得异乎寻常的多有可能是RE incompletely cut。
想了想,可能是我的enzyme的缘故,我用的其中之一是SalI,网上有人提到这个enzyme
has problem with PCR product,所以打算重新设计primer。谢谢大家的帮助,也希
望托大家的福这次可以成功。

【在 T**********t 的大作中提到】
: 不做negative control,就很难troubleshoot啊。再做一次吧,做实验经常是这样,做
: 十次control都没问题,一次偷懒不做就出问题了。所以还是不要怕麻烦,尽量把该做
: 的control都做上。

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c*r
21
有没有positive control啊?有的话也一起做吧,尤其是没结果的时候。

【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次没有长出colony,所以没有设-ve ctrl。。。
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p*i
22
很WS地問,會不會是抗生素壞了……

【在 v***a 的大作中提到】
: 前几次一直长不出colony,换了一个ligase,这次transformation后平板上长得满满趴
: 趴。同时也用了一个uncut的vector做+ve ctrl,长得比有insert的还要满。
: 很高兴。挑了18个colony做PCR check,结果出来傻眼了,什么都没有,光marker那一
: 条lane亮的。大家觉得这是怎么回事啊?多谢多谢!

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i*i
23
首先问楼主
1.PCR出来有条带吗
2.是双酶切吗,单salI必须去磷酸化,引物有保护碱基吗
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v*a
24
PCR check看不到任何条带
是双酶切,用的另一个是MluI,引物前都各加了2个保护碱基
期待高见

【在 i*****i 的大作中提到】
: 首先问楼主
: 1.PCR出来有条带吗
: 2.是双酶切吗,单salI必须去磷酸化,引物有保护碱基吗

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C*e
25
2 个碱基保护未必够
我记得有个表格是说常用限制性内切酶分别需要几个碱基保护、酶切效率是多少
表格不在手边
不过你可以网上搜一下
另外也有可能像我上次遇到的,引物5'端合成的时候就少了
但是看你的描述我觉得更有可能的就是ligation不work
因为某些原因平板张长的都是false positive
ligation之后长满满的一般真不是好事

【在 v***a 的大作中提到】
: PCR check看不到任何条带
: 是双酶切,用的另一个是MluI,引物前都各加了2个保护碱基
: 期待高见

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v*a
26
谢谢!那个表格我查到了。有一个问题啊,每个酶具体用什么保护碱基有章可循吗?比
如单是数量满足就行,还是碱基数量和种类要一样?
你说的ligation的问题我也觉得,那可能根子还在RE上。我再试试。多谢多谢!

【在 C*******e 的大作中提到】
: 2 个碱基保护未必够
: 我记得有个表格是说常用限制性内切酶分别需要几个碱基保护、酶切效率是多少
: 表格不在手边
: 不过你可以网上搜一下
: 另外也有可能像我上次遇到的,引物5'端合成的时候就少了
: 但是看你的描述我觉得更有可能的就是ligation不work
: 因为某些原因平板张长的都是false positive
: ligation之后长满满的一般真不是好事

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C*e
27
碱基保护在数量上
具体什么碱基应该是没有关系的
因为所谓“限制性酶切位点”就已经决定了除开这个识别位点以外、
上游或者下游的序列跟酶切无关
加几个碱基作为“保护”还是可以从名称上想明白为什么
“限制性内切酶”
所谓“内切”
而不是在末端切
就决定了当我们人为的把酶切位点设计在引物末端的时候需要再
加几个碱基以保证可以切得动
除非你不是直接切PCR产物
而是用TA cloning或者TOPO-Blunt end cloning先把PCR产
物放到TA/TOPO vector里面了

【在 v***a 的大作中提到】
: 谢谢!那个表格我查到了。有一个问题啊,每个酶具体用什么保护碱基有章可循吗?比
: 如单是数量满足就行,还是碱基数量和种类要一样?
: 你说的ligation的问题我也觉得,那可能根子还在RE上。我再试试。多谢多谢!

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v*a
28
谢谢谢谢!!!解释得真清楚!

【在 C*******e 的大作中提到】
: 碱基保护在数量上
: 具体什么碱基应该是没有关系的
: 因为所谓“限制性酶切位点”就已经决定了除开这个识别位点以外、
: 上游或者下游的序列跟酶切无关
: 加几个碱基作为“保护”还是可以从名称上想明白为什么
: “限制性内切酶”
: 所谓“内切”
: 而不是在末端切
: 就决定了当我们人为的把酶切位点设计在引物末端的时候需要再
: 加几个碱基以保证可以切得动

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