求建议. 构建转基因细胞系# Biology - 生物学
n*e
1 楼
想要构建转入一个copy外源基因并稳定表达的细胞系.
请问用什么系统?
初步查了一下:
有Talen, Zinc finger.
请推荐价格便宜量又足的kit
谢谢!
请问用什么系统?
初步查了一下:
有Talen, Zinc finger.
请推荐价格便宜量又足的kit
谢谢!
T*u
2 楼
you need learn basic cell biology
【在 n******e 的大作中提到】
: 想要构建转入一个copy外源基因并稳定表达的细胞系.
: 请问用什么系统?
: 初步查了一下:
: 有Talen, Zinc finger.
: 请推荐价格便宜量又足的kit
: 谢谢!
【在 n******e 的大作中提到】
: 想要构建转入一个copy外源基因并稳定表达的细胞系.
: 请问用什么系统?
: 初步查了一下:
: 有Talen, Zinc finger.
: 请推荐价格便宜量又足的kit
: 谢谢!
n*e
3 楼
惭愧。
对于真核生物外源基因表达不是很了解。也有可能是我一开始没有表达很清楚。
主要是因为通过质粒来建立的话对于整合位置，拷贝数目不可控制。
所以想通过这些方法，建立单拷贝，特定位置整合的细胞株。
不知道这个思路是不是存在什么错误，如果有简单的方法，还请指教。多谢多谢！
【在 T****u 的大作中提到】
: you need learn basic cell biology
对于真核生物外源基因表达不是很了解。也有可能是我一开始没有表达很清楚。
主要是因为通过质粒来建立的话对于整合位置，拷贝数目不可控制。
所以想通过这些方法，建立单拷贝，特定位置整合的细胞株。
不知道这个思路是不是存在什么错误，如果有简单的方法，还请指教。多谢多谢！
【在 T****u 的大作中提到】
: you need learn basic cell biology
m*D
4 楼
十年不作这个了，看还记得不记得。
作stable cell line,要单拷贝，你不能切plasmid，要保持plasmid的环。但你不能保
证每个插入的位置（on plasmid），因此插入的位置可能正好在你的表达cassette中间
，所以，要花大量时间来挑选你要的细胞系（PCR应该可以证实）。linearized
plasmid才会有多copy问题。
另外，就是stable cell line的silence问题。你的表达基因会随culture时间而
silence。这个当时是在cassette两边加特定的sequence来防止的（我连名字度不既得
利益了。）。现在不知道是不是有新技术。
另外，我们以前是用bicistronic系统，就是selection marker和你要表达的基因在同
一个mRNA上，中间有一个ribosome进入的IRES sequence,保证两个蛋白质的
translation。这个的好处是能在selection条件下成活的细胞系，表达你的基因的可能
性也大多了。你可以参见clontec的系统。
作stable cell line,要单拷贝，你不能切plasmid，要保持plasmid的环。但你不能保
证每个插入的位置（on plasmid），因此插入的位置可能正好在你的表达cassette中间
，所以，要花大量时间来挑选你要的细胞系（PCR应该可以证实）。linearized
plasmid才会有多copy问题。
另外，就是stable cell line的silence问题。你的表达基因会随culture时间而
silence。这个当时是在cassette两边加特定的sequence来防止的（我连名字度不既得
利益了。）。现在不知道是不是有新技术。
另外，我们以前是用bicistronic系统，就是selection marker和你要表达的基因在同
一个mRNA上，中间有一个ribosome进入的IRES sequence,保证两个蛋白质的
translation。这个的好处是能在selection条件下成活的细胞系，表达你的基因的可能
性也大多了。你可以参见clontec的系统。
T*u
5 楼
Then that's knockin cell line to a specific position.
Cas9 and TALEN will help.
【在 n******e 的大作中提到】
: 惭愧。
: 对于真核生物外源基因表达不是很了解。也有可能是我一开始没有表达很清楚。
: 主要是因为通过质粒来建立的话对于整合位置，拷贝数目不可控制。
: 所以想通过这些方法，建立单拷贝，特定位置整合的细胞株。
: 不知道这个思路是不是存在什么错误，如果有简单的方法，还请指教。多谢多谢！
Cas9 and TALEN will help.
【在 n******e 的大作中提到】
: 惭愧。
: 对于真核生物外源基因表达不是很了解。也有可能是我一开始没有表达很清楚。
: 主要是因为通过质粒来建立的话对于整合位置，拷贝数目不可控制。
: 所以想通过这些方法，建立单拷贝，特定位置整合的细胞株。
: 不知道这个思路是不是存在什么错误，如果有简单的方法，还请指教。多谢多谢！
h*y
6 楼
Flp in
【在 n******e 的大作中提到】
: 想要构建转入一个copy外源基因并稳定表达的细胞系.
: 请问用什么系统?
: 初步查了一下:
: 有Talen, Zinc finger.
: 请推荐价格便宜量又足的kit
: 谢谢!
【在 n******e 的大作中提到】
: 想要构建转入一个copy外源基因并稳定表达的细胞系.
: 请问用什么系统?
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: 请推荐价格便宜量又足的kit
: 谢谢!
n*e
7 楼
多谢这么详细的解答!
还真的不知道这个线性化的trick.
不过,用质粒系统还是觉得会有像你说的silence的问题.
我就是用质粒系统做了瞬时转染,得到了初步结果.
还是十分感谢详细解答!
【在 m*********D 的大作中提到】
: 十年不作这个了，看还记得不记得。
: 作stable cell line,要单拷贝，你不能切plasmid，要保持plasmid的环。但你不能保
: 证每个插入的位置（on plasmid），因此插入的位置可能正好在你的表达cassette中间
: ，所以，要花大量时间来挑选你要的细胞系（PCR应该可以证实）。linearized
: plasmid才会有多copy问题。
: 另外，就是stable cell line的silence问题。你的表达基因会随culture时间而
: silence。这个当时是在cassette两边加特定的sequence来防止的（我连名字度不既得
: 利益了。）。现在不知道是不是有新技术。
: 另外，我们以前是用bicistronic系统，就是selection marker和你要表达的基因在同
: 一个mRNA上，中间有一个ribosome进入的IRES sequence,保证两个蛋白质的
还真的不知道这个线性化的trick.
不过,用质粒系统还是觉得会有像你说的silence的问题.
我就是用质粒系统做了瞬时转染,得到了初步结果.
还是十分感谢详细解答!
【在 m*********D 的大作中提到】
: 十年不作这个了，看还记得不记得。
: 作stable cell line,要单拷贝，你不能切plasmid，要保持plasmid的环。但你不能保
: 证每个插入的位置（on plasmid），因此插入的位置可能正好在你的表达cassette中间
: ，所以，要花大量时间来挑选你要的细胞系（PCR应该可以证实）。linearized
: plasmid才会有多copy问题。
: 另外，就是stable cell line的silence问题。你的表达基因会随culture时间而
: silence。这个当时是在cassette两边加特定的sequence来防止的（我连名字度不既得
: 利益了。）。现在不知道是不是有新技术。
: 另外，我们以前是用bicistronic系统，就是selection marker和你要表达的基因在同
: 一个mRNA上，中间有一个ribosome进入的IRES sequence,保证两个蛋白质的
n*e
8 楼
谢谢指点!
我也是这么想的.就是想问问那个公司的kit效率高又便宜的.
【在 T****u 的大作中提到】
: Then that's knockin cell line to a specific position.
: Cas9 and TALEN will help.
我也是这么想的.就是想问问那个公司的kit效率高又便宜的.
【在 T****u 的大作中提到】
: Then that's knockin cell line to a specific position.
: Cas9 and TALEN will help.
n*e
9 楼
多谢!
也有文献提到这个.
主要是不想自己折腾,还是买成熟的kit或者直接找公司做.
【在 h***y 的大作中提到】
: Flp in
也有文献提到这个.
主要是不想自己折腾,还是买成熟的kit或者直接找公司做.
【在 h***y 的大作中提到】
: Flp in
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