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被慢病毒折腾惨了，大家帮忙看看吧

被慢病毒折腾惨了，大家帮忙看看吧# Biology - 生物学

j*n2014-01-26 08:01

1 楼

电面聊的挺开心
之后询问状态 committee chair也很积极但没明说只说对我的研究很感兴趣
可惜最后收到的消息是 committee推荐了我，但internal approval没过
还以为这种情况只会发生在发offer或者评tenure的时候 department过了但dean或者
provost没过

l*32014-01-26 08:01

2 楼

我把一个6k多的基因放进了慢病毒载体，基因和GFP共用一个启动子，中间IRES连接，
现在转293大约有50%绿的，收了病毒感染靶细胞就没有绿的了。
这么大的能包装出来吗？是不是一定要浓缩病毒？
谢谢了

t*12014-01-26 08:01

3 楼

是系里投票环节卡住了吧。是不是跟个别的faculty单独聊的时候有不大顺利的情况？

j*n2014-01-26 08:01

4 楼

这么大的基因没经验最多只做过3kb的不过感觉293也就只有50%的话这个很玄啊
还有个情况你确信你的目的基因没有表达么？我倒是遇到过IRES在某些情况下受抑制
的情况 IRES后面那个蛋白（你的情况是GFP）可能受抑制

g*62014-01-26 08:01

5 楼

他意思是电面吧，还没到onsite?

【在 t*********1 的大作中提到】

: 是系里投票环节卡住了吧。是不是跟个别的faculty单独聊的时候有不大顺利的情况？

l*32014-01-26 08:01

6 楼

您说的是，以前是听说过IRES下游的基因会被抑制，我可能是可以检测一下目的蛋白，
但是如果GFP不表达，就算上游我的目的基因表达了，可能也不行，因为我是想下一步
直接去sorting GFP+的细胞的。
那个基因太大，我要转的特定的细胞又长得太慢，真是麻烦~~
还是谢谢啦~

【在 j******n 的大作中提到】

: 这么大的基因没经验最多只做过3kb的不过感觉293也就只有50%的话这个很玄啊
: 还有个情况你确信你的目的基因没有表达么？我倒是遇到过IRES在某些情况下受抑制
: 的情况 IRES后面那个蛋白（你的情况是GFP）可能受抑制

m*u2014-01-26 08:01

7 楼

估计是他们改变主意了，不想让你去了

【在 j****n 的大作中提到】

: 电面聊的挺开心
: 之后询问状态 committee chair也很积极但没明说只说对我的研究很感兴趣
: 可惜最后收到的消息是 committee推荐了我，但internal approval没过
: 还以为这种情况只会发生在发offer或者评tenure的时候 department过了但dean或者
: provost没过

a*a2014-01-26 08:01

8 楼

我试过，包不出来，浓缩也不绿
30ml to 100ul

【在 l******3 的大作中提到】

: 我把一个6k多的基因放进了慢病毒载体，基因和GFP共用一个启动子，中间IRES连接，
: 现在转293大约有50%绿的，收了病毒感染靶细胞就没有绿的了。
: 这么大的能包装出来吗？是不是一定要浓缩病毒？
: 谢谢了

n*l2014-01-26 08:01

9 楼

我以前有过经历，就是电话面试之后search committee把我排在第二，但是系主任把我
从onsite名单中拿掉了。这个没办法，committee也只是作出推荐而已。有些系估计是
committee全权决定，有些系估计是系主任做决定邀请谁面试，有些系是全系投票做决
定。

【在 j****n 的大作中提到】

l*32014-01-26 08:01

10 楼

那你后来用什么方法做的呢？但是也有人做出来啊，不管怎么样，我还是浓缩一下试试
~~

【在 a*******a 的大作中提到】

: 我试过，包不出来，浓缩也不绿
: 30ml to 100ul

j*n2014-01-26 08:01

11 楼

明白看来这里面水也很深

【在 n*******l 的大作中提到】

: 我以前有过经历，就是电话面试之后search committee把我排在第二，但是系主任把我
: 从onsite名单中拿掉了。这个没办法，committee也只是作出推荐而已。有些系估计是
: committee全权决定，有些系估计是系主任做决定邀请谁面试，有些系是全系投票做决
: 定。

a*a2014-01-26 08:01

12 楼

后来放弃了。
我做的最大的是3.2k+ires gfp,大概2%阳性
5.9k无marker, if显示有大约0.5%阳性。
in mouse es

【在 l******3 的大作中提到】

: 那你后来用什么方法做的呢？但是也有人做出来啊，不管怎么样，我还是浓缩一下试试
: ~~

a*l2014-01-26 08:01

13 楼

我申请的职位，招工广告上写的是A或B方向，我做A方向的就申请了，电面时和系主任
、几个faculty都聊得很愉快，但后来他们决定目前先招B方向的

【在 j****n 的大作中提到】

: 明白看来这里面水也很深

l*r2014-01-26 08:01

14 楼

浓缩后infect, 再用infected cell 试试FACS?

d*t2014-01-26 08:01

15 楼

没办法，随片断上升lentivirus呈log下降，只能浓缩再浓缩，然后sorting

【在 l******3 的大作中提到】

s*r2014-01-26 08:01

16 楼

确定整个packaging system是work的？有没有弄个小的gene进去包包看
我们经常包4-5kb的插入，titer低点但是能包出来，不过你这个加gfp要7kb多快8kb了

【在 l******3 的大作中提到】

j*i2014-01-26 08:01

17 楼

transfection 50%太低了应该有100%的啊你的transfection可能有问题有普通的gfp
plasmid对照吗另外 gfp是必须的吗如果不是必须就去掉吧或则用2a连接

【在 l******3 的大作中提到】

l*32014-01-26 08:01

18 楼

50%是目测的GFP，会不会像上面说的，6k的基因在上游，GFP在下游，中间IRES连接，
所以导致GFP的表达受影响。我是想去sorting GFP阳性的细胞建这个基因高表达的细胞
系。

gfp

【在 j******i 的大作中提到】

: transfection 50%太低了应该有100%的啊你的transfection可能有问题有普通的gfp
: plasmid对照吗另外 gfp是必须的吗如果不是必须就去掉吧或则用2a连接

j*i2014-01-26 08:01

19 楼

IRES确实会导致不平衡表达，以致后边的gfp表达强度弱，但是正常情况下，也应该是
90-100% transfection efficiency,只不过gfp看起来很暗。如果要建立高表达细胞系
的话，可以不要gfp, 最后检测proviral DNA或者mRNA.
其实，你这个情况完全可以不用慢病毒。用piggyBac转座子更方便。piggyBac可以插入
100kb的dna。

【在 l******3 的大作中提到】

: 50%是目测的GFP，会不会像上面说的，6k的基因在上游，GFP在下游，中间IRES连接，
: 所以导致GFP的表达受影响。我是想去sorting GFP阳性的细胞建这个基因高表达的细胞
: 系。
:
: gfp

l*12014-01-26 08:01

20 楼

LZ can try phage λ vector with λ D1180-GFP, or
D1180 luciferase
PMID 23282641
Cold Spring Harb Protoc. 2013 (1).
DNA delivery into mammalian cells using bacteriophage λ displaying the TAT
transduction domain.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23282641
or
http://cshprotocols.cshlp.org/content/2013/1/pdb.prot072660.abs
or
Super Cos
How much space does SuperCos I have for foreign DNA?
52 kbp - 7.6 kbp = 44.4 kbp
http://www.csun.edu/~hcbio027/biotechnology/lec2/VE/VE.htm
>
发信人: jessecai (jesse), 信区: Biology
标题: Re: 被慢病毒折腾惨了，大家帮忙看看吧
发信站: BBS 未名空间站 (Mon Jan 27 13:25:57 2014, 美东)
IRES确实会导致不平衡表达，以致后边的gfp表达强度弱，但是正常情况下，也应该是
90-100% transfection efficiency,只不过gfp看起来很暗。如果要建立高表达细胞系
的话，可以不要gfp, 最后检测proviral DNA或者mRNA.
其实，你这个情况完全可以不用慢病毒。用piggyBac转座子更方便。piggyBac可以插入
100kb的dna。
>>

【在 l******3 的大作中提到】

s*s2014-01-26 08:01

21 楼

1. 大的效率低，没办法
2. IRES太垃圾，大家早就应该统一转2A了
3. 293 50%绿的，是转化的问题
4. 如果是低表达，肉眼可能看不出来，用显微镜照照片和control比较
应该可以。
5.. 293可以表达病毒rna上的基因，不等于能表达mRNA，你确定你的病
毒没构建错误，启动子也合适？

【在 l******3 的大作中提到】

C*S2014-01-26 08:01

22 楼

从一个网页上看到这段话：
For any lentiviral vector, the maximum insert size is 5.0kb, above which
will exceed the lentiviral virus packaging limit. This will result in
minimal or no packaging of viral particles. For complex lentiviral vectors,
such as dual promoter constructs or constructs with reporters and/or other
features, maximum insert size can be as small as 3.0kb. For insert sizes
over 5.0kb, removal of selection markers and selection marker promoters will
help to accommodate these larger inserts.

d*i2014-01-26 08:01

23 楼

呵呵，也是从网上来的。。。。。。。。
One disadvantage associated with lentiviral vectors is the insert size. For
most lentiviral vectors developed, the maximum insert size is 5.0 kb. Insert
sizes less than 3.0kb can be efficiently produced at a high titer in
packaging 293T cells. Viral titers will be significantly decreased by
inserts longer than 3.0kb. As the SV40 genome is over 5.0kb, the expected
Lenti-SV40 titer is relatively low.
http://www.capitalbiosciences.com/system/data/files/15209699324

m*t2014-01-26 08:01

24 楼

我遇到一样的事情。一定WB 你的TARGET PROTEIN，INFECT ５-６天后

d*32014-01-26 08:01

25 楼

J Gene Med. 2007 Jul;9(7):579-84.
Optimized production and concentration of lentiviral vectors containing
large inserts.
al Yacoub N, Romanowska M, Haritonova N, Foerster J.
Author information
Abstract
Generation of high titer lentiviral stocks and efficient virus concentration
are central to maximize the utility of lentiviral technology. Here we
evaluate published protocols for lentivirus production on a range of
transfer vectors differing in size (7.5-13.2 kb). We present a modified
virus production protocol robustly yielding useful titers (up to 10(7)/ml)
for a range of different transfer vectors containing packaging inserts up to
7.5 kb. Moreover, we find that virus recovery after concentration by
ultracentrifugation depends on the size of the packaged inserts, heavily
decreasing for large packaged inserts. We describe a fast (4 h)
centrifugation protocol at reduced speed allowing high virus recovery even
for large and fragile lentivirus vectors. The protocols outlined in the
current report should be useful for many labs interested in producing and
concentrating high titer lentiviral stocks.
PMID: 17533614 [PubMed - indexed for MEDLINE]