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如何用生物化学方法证明蛋白中的一段小肽（17 aa）是alpha序列？

如何用生物化学方法证明蛋白中的一段小肽（17 aa）是alpha序列？# Biology - 生物学

g*e2014-04-15 07:04

1 楼

CS 专业
今天google scholar的时候，
突然发现自己09年一篇会议文章引用了100次了，评价相当不错，
其他的包括第三作者加起来也就不到30次。
所以想试试eb1b？
1. 6篇文章，其中一个3作。还有两个中文的，我都都不知道能不能找到原始出处了。
估计要沸点劲。
2. 130个引用
3. 行业第一的公司，工资薪水都不错（要证明材料？？？）
4，phD on leave, only a masters
5. 2个review，刚开始review，。。。
6. 一个中国专利。
7. 6 7 个推荐信。不同国家。
之前公司已经申了perm，我还可以申EB1B么，现在？？

e*r2014-04-15 07:04

2 楼

正在研究一个细胞膜受体，胞外区与胞内区连接处只有17个aa,预测是一段alpha序列。
受到 ligand 刺激后，这段序列的螺旋度可能发生变构反应，激活胞内区的激酶活性。
因为是膜蛋白，做3D结构是不现实的，俺们也不懂。请问用什么样的生物化学或遗传学
方法可以证明这个肽段是alpha序列，并且会变构。看文献有些是在前面连一个coiled-
coil序列，有木有更直接一些的方法？

d*i2014-04-15 07:04

3 楼

感觉背景挺强的啊，没有phd也可以一试，证明做的是research方面的工作就行

s*y2014-04-15 07:04

4 楼

如果你不想知道具体结构，只想知道是不是alpha helix 的话，
貌似可以用红外旋光法circular dichroism? 我的记忆中这个好像是可以放在有机溶液
里面测的，所以可以大致的模拟膜的分子条件。
http://en.wikipedia.org/wiki/Circular_dichroism
http://en.wikipedia.org/wiki/Vibrational_circular_dichroism
你说的那个变构，如果指的是膜外面的变构比较容易一些，但是如果是指膜里面的变构
则比较麻烦，需要根据具体的序列来设计比较微妙的实验。比方说，可以用荧光标记法
，把肽链上一个很靠近膜（但是不是在膜里面！）的残基的侧链标上荧光。然后如果膜
里面的序列变构了，一般都会影响到在膜里面走的序列的长度，就一般都会使得那个刚
好在膜外的残基要么就是离膜更近了要么就是更远了，反正一般都会使得荧光产生变化
, 因为荧光分子和hydrophobic surface (lipid etc.)的距离会影响荧光强度甚至波长。

coiled-

【在 e********r 的大作中提到】

: 正在研究一个细胞膜受体，胞外区与胞内区连接处只有17个aa,预测是一段alpha序列。
: 受到 ligand 刺激后，这段序列的螺旋度可能发生变构反应，激活胞内区的激酶活性。
: 因为是膜蛋白，做3D结构是不现实的，俺们也不懂。请问用什么样的生物化学或遗传学
: 方法可以证明这个肽段是alpha序列，并且会变构。看文献有些是在前面连一个coiled-
: coil序列，有木有更直接一些的方法？

g*e2014-04-15 07:04

5 楼

~~~~~~
就是这个很难啊，现在的工作和以前的工作除了machine learning上有点相关外，
几乎没有任何关系。

【在 d***i 的大作中提到】

: 感觉背景挺强的啊，没有phd也可以一试，证明做的是research方面的工作就行

p*s2014-04-15 07:04

6 楼

你所谓的alpha序列是指alpha helix么？一般来说如果在膜内只有一个跨膜域的蛋白，
并且是单体，跨膜域只能是alpha helix。想直接证明可能需要生物物理方法，例如NMR
, EPR或者FRET什么的。变构是什么意思？好像RTK之类的蛋白是由于二聚被激活呀。

coiled-

【在 e********r 的大作中提到】

p*s2014-04-15 07:04

7 楼

这倒提醒我了，也许可以直接用Tryptophan荧光，应该可以反映构象变化

【在 s******y 的大作中提到】

: 如果你不想知道具体结构，只想知道是不是alpha helix 的话，
: 貌似可以用红外旋光法circular dichroism? 我的记忆中这个好像是可以放在有机溶液
: 里面测的，所以可以大致的模拟膜的分子条件。
: http://en.wikipedia.org/wiki/Circular_dichroism
: http://en.wikipedia.org/wiki/Vibrational_circular_dichroism
: 你说的那个变构，如果指的是膜外面的变构比较容易一些，但是如果是指膜里面的变构
: 则比较麻烦，需要根据具体的序列来设计比较微妙的实验。比方说，可以用荧光标记法
: ，把肽链上一个很靠近膜（但是不是在膜里面！）的残基的侧链标上荧光。然后如果膜
: 里面的序列变构了，一般都会影响到在膜里面走的序列的长度，就一般都会使得那个刚
: 好在膜外的残基要么就是离膜更近了要么就是更远了，反正一般都会使得荧光产生变化

d*n2014-04-15 07:04

8 楼

楼主这种思路下去，就已经有走向千老不归路的倾向了。
1. 就算其他区域发生构想变化，也会带动该区域变化。而且可以想的出来这肯定多说
有变化的。问题是花你宝贵的时间和有限的funding解决这个问题，值得么？
2. 看看人类有没有什么疾病与该区域或该protein有关
3. 看看该区域有没有很多的snp，如果太多，很可能说明它对该区域功能不是太重要，
或即使真个protein功能丧失对整个细胞和人体无关紧要。
当然，除非这个protein knockout的phenotype非常明显，或者是目前相当热的一个
protein，否则楼主还是找的别的project好。具体再聊。

s*22014-04-15 07:04

9 楼

哥们儿你太sharp了！

【在 d********n 的大作中提到】

: 楼主这种思路下去，就已经有走向千老不归路的倾向了。
: 1. 就算其他区域发生构想变化，也会带动该区域变化。而且可以想的出来这肯定多说
: 有变化的。问题是花你宝贵的时间和有限的funding解决这个问题，值得么？
: 2. 看看人类有没有什么疾病与该区域或该protein有关
: 3. 看看该区域有没有很多的snp，如果太多，很可能说明它对该区域功能不是太重要，
: 或即使真个protein功能丧失对整个细胞和人体无关紧要。
: 当然，除非这个protein knockout的phenotype非常明显，或者是目前相当热的一个
: protein，否则楼主还是找的别的project好。具体再聊。

s*y2014-04-15 07:04

10 楼

有一定道理。但是看楼主问的样子，有可能是这个蛋白已经是他们实验室已经做了不少
工作的了，应该是已经确定和疾病有关的了。

【在 d********n 的大作中提到】

e*r2014-04-15 07:04

11 楼

哇，好专业，谢谢！但不知红外旋光法circular dichroism是否能够在整个蛋白构象中
，就只识别这17个aa的构象。另外，这17个aa正好是在膜外面，最靠近胞质的地方，我
想你说的荧光标记法应该可以试试。

【在 s******y 的大作中提到】

e*r2014-04-15 07:04

12 楼

唔，这17个aa不在tansmembrane helix里头，而是正好在膜向着胞质的那一头。这个受
体形成dimer是天生的，我们怀疑17个aa形成的helix可能在识别到ligand后，会扭得更
厉害。

NMR

【在 p****s 的大作中提到】

: 你所谓的alpha序列是指alpha helix么？一般来说如果在膜内只有一个跨膜域的蛋白，
: 并且是单体，跨膜域只能是alpha helix。想直接证明可能需要生物物理方法，例如NMR
: , EPR或者FRET什么的。变构是什么意思？好像RTK之类的蛋白是由于二聚被激活呀。
:
: coiled-

e*r2014-04-15 07:04

13 楼

兄弟，你这段话让我等泪奔如江河啊，呵呵。
不归路是木有办法了，因为这个蛋白在我们这个小领域里还是很重要的一个明星分子，
当然，是小领域......。

【在 d********n 的大作中提到】

e*r2014-04-15 07:04

14 楼

是滴，这是个细菌滴信号蛋白已经被研究了30年了，有很多工作放在前头。最关键的一
点，是它调控quorum sensing过程，细菌领域里头的大热门，所以我们正在折腾它，呵
呵。
您的意思是不是：这么做已经做得太细了？

【在 s******y 的大作中提到】

: 有一定道理。但是看楼主问的样子，有可能是这个蛋白已经是他们实验室已经做了不少
: 工作的了，应该是已经确定和疾病有关的了。

s*y2014-04-15 07:04

15 楼

如果你打算用CD spectra的话，直接化学合成那一小段肽链即可。最好不要看看整个的
蛋白。而且你这个蛋白如果是过膜蛋白的话提纯起来可不是一般的麻烦。

【在 e********r 的大作中提到】

: 哇，好专业，谢谢！但不知红外旋光法circular dichroism是否能够在整个蛋白构象中
: ，就只识别这17个aa的构象。另外，这17个aa正好是在膜外面，最靠近胞质的地方，我
: 想你说的荧光标记法应该可以试试。

s*y2014-04-15 07:04

16 楼

细不细只有你以及你老板最清楚。
既然你们很确认这个蛋白是很重要的蛋白，而且你说的那段肽链的构型和蛋白的功能能
很有可能有关的话，那就放手大胆的去做吧。

【在 e********r 的大作中提到】

: 是滴，这是个细菌滴信号蛋白已经被研究了30年了，有很多工作放在前头。最关键的一
: 点，是它调控quorum sensing过程，细菌领域里头的大热门，所以我们正在折腾它，呵
: 呵。
: 您的意思是不是：这么做已经做得太细了？

e*r2014-04-15 07:04

17 楼

你说的对，我们可以合成这段小肽然后用CD试试。不过这么做还不能解决前面的跨膜区
感应到ligand后，信号传过来如何改变它的构象这个核心问题。这个如何破？另外，我
就是我的老板，呵呵......

【在 s******y 的大作中提到】

: 如果你打算用CD spectra的话，直接化学合成那一小段肽链即可。最好不要看看整个的
: 蛋白。而且你这个蛋白如果是过膜蛋白的话提纯起来可不是一般的麻烦。

s*y2014-04-15 07:04

18 楼

靠！如果你就是老板的话那我可要收咨询费了！呵呵。
关于你说的“跨膜区感应到ligand后，信号传过来如何改变它的构象”这个问题我不是
很明白。
你说的这段17 Aa 肽链到底是在细胞内还是细胞外？

【在 e********r 的大作中提到】

: 你说的对，我们可以合成这段小肽然后用CD试试。不过这么做还不能解决前面的跨膜区
: 感应到ligand后，信号传过来如何改变它的构象这个核心问题。这个如何破？另外，我
: 就是我的老板，呵呵......

n*y2014-04-15 07:04

19 楼

按你的要求，只能用这个蛋白的胞外区跨膜区17aa来验证你的假设。CD只能告诉你
alpha-helix,beta-sheet等在整个蛋白中的比例，你加入ligand后，17aa假设有变化，
在整个蛋白和ligand（如果是蛋白的话，就算是其他的chemical可能也有影响）在CD的
变化中，你也不能说变化就是这17aa的。
你可以找个Cryo-EM看看。

q*g2014-04-15 07:04

20 楼

我怎么觉得你说的这个方向才是不归路呢？
人家只是做基础研究，对某个蛋白感兴趣而已。不一定所有的研究都要和疾病有关阿。

【在 d********n 的大作中提到】

d*12014-04-15 07:04

21 楼

CD, FRET,对于这么小的区域，基本没戏， resolution没有那么高。
这个最简单的就是用NMR，找个熟悉的实验室，半年出结果。

coiled-

【在 e********r 的大作中提到】

p*s2014-04-15 07:04

22 楼

关键还是膜蛋白，也许要用固相NMR？

【在 d******1 的大作中提到】

: CD, FRET,对于这么小的区域，基本没戏， resolution没有那么高。
: 这个最简单的就是用NMR，找个熟悉的实验室，半年出结果。
:
: coiled-

d*12014-04-15 07:04

23 楼

08和09年，有一个俄国的实验，连续发了3-4片JBC， JMB， BiophysicalJournal 文
章解析single transmembrane helix of Eph A4, ErbB2 and others 的文章，he
solved the monomeric and dimeric structures of these proteins.基本上半年一片
。而且实验花费极少（俄国毕竟没钱）。现在6年过去了，这种实验只会越来越简单
。

【在 p****s 的大作中提到】

: 关键还是膜蛋白，也许要用固相NMR？

d*12014-04-15 07:04

24 楼

液相NMR

【在 p****s 的大作中提到】

: 关键还是膜蛋白，也许要用固相NMR？

p*s2014-04-15 07:04

25 楼

太难，如果总分子量超过25 kDa就很难做了。如果用detergent能不能模拟体内环境又
有问题

【在 d******1 的大作中提到】

: 液相NMR

d*12014-04-15 07:04

26 楼

: 太难，如果总分子量超过25 kDa就很难做了。如果用detergent能不能模拟体内环境又
: 有问题

e*r2014-04-15 07:04

27 楼

这段肽段是在胞质内，但其N端紧接着transmembrane region。C端紧接着kinase
domain。

【在 s******y 的大作中提到】

: 靠！如果你就是老板的话那我可要收咨询费了！呵呵。
: 关于你说的“跨膜区感应到ligand后，信号传过来如何改变它的构象”这个问题我不是
: 很明白。
: 你说的这段17 Aa 肽链到底是在细胞内还是细胞外？

e*r2014-04-15 07:04

28 楼

你说得太清楚了，涨了不少姿势。不过，Cryo-EM太高大上了，能否就用遗传或生化的
方法搞搞再说？

【在 n***y 的大作中提到】

: 按你的要求，只能用这个蛋白的胞外区跨膜区17aa来验证你的假设。CD只能告诉你
: alpha-helix,beta-sheet等在整个蛋白中的比例，你加入ligand后，17aa假设有变化，
: 在整个蛋白和ligand（如果是蛋白的话，就算是其他的chemical可能也有影响）在CD的
: 变化中，你也不能说变化就是这17aa的。
: 你可以找个Cryo-EM看看。

e*r2014-04-15 07:04

29 楼

NMR是好，但结构的东东，用在我们这类蛋白上基本同戏，这个要搞早有人整出来了，
可能方法上还是有难度滴。

【在 d******1 的大作中提到】

: CD, FRET,对于这么小的区域，基本没戏， resolution没有那么高。
: 这个最简单的就是用NMR，找个熟悉的实验室，半年出结果。
:
: coiled-

e*r2014-04-15 07:04

30 楼

同意，全长有78 kd。不过我们已经构建了这个受体激酶全长的proteoliposome,激酶活
性还相当不错。不过这玩意毕竟是的nano颗粒，结构生物学的方法不好使啊.....正因
如此，想能否用遗传或生化的方法解决。NMR, X ray,Cryo EM感脚难度过大，也不懂。

【在 p****s 的大作中提到】

: 太难，如果总分子量超过25 kDa就很难做了。如果用detergent能不能模拟体内环境又
: 有问题

p*s2014-04-15 07:04

31 楼

用间接证据也行，alanine scanning吧，算是遗传和生化的结合，起码能知道重要的位
点有哪些。（不过没人做过么？）

【在 e********r 的大作中提到】

: 你说得太清楚了，涨了不少姿势。不过，Cryo-EM太高大上了，能否就用遗传或生化的
: 方法搞搞再说？

p*s2014-04-15 07:04

32 楼

哈哈，居然已经做到这种程度了啊。Cryo EM对你来说分辨率太低了，17个氨基酸估计
最多也就2 nm，很难看出差别。如果你预测有构象能导致距离变化的话，也许可以用
EPR，但是需要修饰。

【在 e********r 的大作中提到】

: 同意，全长有78 kd。不过我们已经构建了这个受体激酶全长的proteoliposome,激酶活
: 性还相当不错。不过这玩意毕竟是的nano颗粒，结构生物学的方法不好使啊.....正因
: 如此，想能否用遗传或生化的方法解决。NMR, X ray,Cryo EM感脚难度过大，也不懂。

p*s2014-04-15 07:04

33 楼

查了一下，那个只是TM domain。楼主想做的是全长蛋白中的其中一段，而且不是
integral transmembrane的部分，真正的结构什么样很难预测。

【在 d******1 的大作中提到】

: 08和09年，有一个俄国的实验，连续发了3-4片JBC， JMB， BiophysicalJournal 文
: 章解析single transmembrane helix of Eph A4, ErbB2 and others 的文章，he
: solved the monomeric and dimeric structures of these proteins.基本上半年一片
: 。而且实验花费极少（俄国毕竟没钱）。现在6年过去了，这种实验只会越来越简单

e*r2014-04-15 07:04

34 楼

唔，这个我们也在想，其实不难，17个aa一会儿就突掉了，里面还确实没有影响alpha
helix的那几种氨基酸，比如Pro, Gly什么的。所以我们在想如果把关键位点突成P或G
，一定会破坏alpha helix，得到loss of function的结果。但能不能有目的地突成别
的氨基酸，从而获得gain of function的突变体呢（比如不加ligand就能得到很高的激
酶活性，这个酶活我们能检测）？怎么做突变更显得有智慧？呵呵。

【在 p****s 的大作中提到】

: 用间接证据也行，alanine scanning吧，算是遗传和生化的结合，起码能知道重要的位
: 点有哪些。（不过没人做过么？）

e*r2014-04-15 07:04

35 楼

谢谢哈，我去查一查您说的EPR是啥子东东.....回家了，明天再看。

【在 p****s 的大作中提到】

: 哈哈，居然已经做到这种程度了啊。Cryo EM对你来说分辨率太低了，17个氨基酸估计
: 最多也就2 nm，很难看出差别。如果你预测有构象能导致距离变化的话，也许可以用
: EPR，但是需要修饰。

p*s2014-04-15 07:04

36 楼

在膜表面的话可以每隔3-4个氨基酸引入一个带电的氨基酸我猜？可以跟磷脂形成相互
作用

alpha
G

【在 e********r 的大作中提到】

: 唔，这个我们也在想，其实不难，17个aa一会儿就突掉了，里面还确实没有影响alpha
: helix的那几种氨基酸，比如Pro, Gly什么的。所以我们在想如果把关键位点突成P或G
: ，一定会破坏alpha helix，得到loss of function的结果。但能不能有目的地突成别
: 的氨基酸，从而获得gain of function的突变体呢（比如不加ligand就能得到很高的激
: 酶活性，这个酶活我们能检测）？怎么做突变更显得有智慧？呵呵。

d*12014-04-15 07:04

37 楼

这样，除了间接的方法，就只有长晶体结构了。 78Kda的蛋白做EM，观察17AA的片段。
很容易看不见。
剩下的方法就只能用ala or cys screening 和外接coiled coil了。然后猜一下，看
看是不是和其他实验吻合。

【在 p****s 的大作中提到】

: 查了一下，那个只是TM domain。楼主想做的是全长蛋白中的其中一段，而且不是
: integral transmembrane的部分，真正的结构什么样很难预测。

d*12014-04-15 07:04

38 楼

你应该是想看jurtamembrane domain的功能。 John Kuriyan, 2010还是2011年有一片
关于jurtamembrane domain激活her2 kinase domain的science还是cell的文章。可以
参考一下。

【在 e********r 的大作中提到】

: NMR是好，但结构的东东，用在我们这类蛋白上基本同戏，这个要搞早有人整出来了，
: 可能方法上还是有难度滴。

s*y2014-04-15 07:04

39 楼

这样子的啊，你早说清楚啊！我还以为你说的是这段17Aa 贯穿membrane 一部分在外一
部分在内呢！所以我上面建议的有机溶剂里的CD spectra 以及大家建议的固相NMR其实
都是针对过膜的片段的。你研究的那段序列如果都是在细胞质内部的话我们给你的建议
会有很大的不同。
首先，既然是在细胞内部的，那么大致应该是一个水溶性的片段。所以如果要看构相是
不是一个alpha-helix 的话，直接把那一段１７个氨基酸找公司合成了然后直接用一般
的水相NMR即可。这个是非常简单的活。随便找个做结构的实验室或者core facility帮
一下忙即可。说不定某些公司都能帮你做。如果你仅仅是想简单看看是不是alpha-
helix也行，非常简单的CD spectra也行，很多大学的open access core facility 都
能做，只不过不能告诉你特别具体的结构而已。
但是你要看那个结构的变化这个比较伤脑筋。不要往冷冻电镜动心思了，目前的分析度
没有那么高，而且对动态变化的分析很麻烦的。
而且因为你要看膜外的部位对膜内的部位的影响，这个是一个很麻烦的问题。最直接的
答案是暴力上膜蛋白结晶，带ligand 以及不带ligand来进行对比。但是很多膜蛋白都
是很难对付的。我看你的实验室大概也没有这个能力。
目前要回答这种问题，如果没有能力直接回答的话就只好间接回答。常见的方法是搞一
个recombinant protein, 把kinase 那部分去掉换成不同的reporter（比方说荧光蛋白
）来推测那一段17Aa的构型变化。或者把你那一段17Aa序列里最靠近膜的残基换成
tryptophan之类的有intrinsic fluorescence 的氨基酸, 然后看看外面的受体结合
ligand之后是否会导致tryptophan的自发荧光增强或者减弱。

【在 e********r 的大作中提到】

: 这段肽段是在胞质内，但其N端紧接着transmembrane region。C端紧接着kinase
: domain。

t*x2014-04-15 07:04

40 楼

solution nmr 做这种小peptide还是很猛的
不知道你做的和下面这篇文章是不是比较类似的东西
（Regulation of T Cell Receptor Activation by Dynamic Membrane Binding of
the CD3ɛ Cytoplasmic Tyrosine-Based Motif）

e*r2014-04-15 07:04

41 楼

热情感谢胖头鱼提这么多建议。在结构方便我们绝对是小白，所以才想着用生化或遗传
的方法来试一下。你说的Try标记我们准备先做一下再看，希望能够看到有意思的结果。

【在 s******y 的大作中提到】

: 这样子的啊，你早说清楚啊！我还以为你说的是这段17Aa 贯穿membrane 一部分在外一
: 部分在内呢！所以我上面建议的有机溶剂里的CD spectra 以及大家建议的固相NMR其实
: 都是针对过膜的片段的。你研究的那段序列如果都是在细胞质内部的话我们给你的建议
: 会有很大的不同。
: 首先，既然是在细胞内部的，那么大致应该是一个水溶性的片段。所以如果要看构相是
: 不是一个alpha-helix 的话，直接把那一段１７个氨基酸找公司合成了然后直接用一般
: 的水相NMR即可。这个是非常简单的活。随便找个做结构的实验室或者core facility帮
: 一下忙即可。说不定某些公司都能帮你做。如果你仅仅是想简单看看是不是alpha-
: helix也行，非常简单的CD spectra也行，很多大学的open access core facility 都
: 能做，只不过不能告诉你特别具体的结构而已。