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求助基于Invitrogen pLenti载体的Tet-One系统
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求助基于Invitrogen pLenti载体的Tet-One系统# Biology - 生物学
t*1
1
2010-03-28 中國時報【中央社】
 僅在數年之前,美國電子業經常會相互探詢:「貴公司在中國拓展業務的策略為
何?」如今問題可能改為:「貴公司在中國遭遇甚麼難題?」
 美國「聖荷西信使新聞」報(San Jose MercuryNews)報導,中國大陸目前對外
資的吸引力更勝以往,當地的生產成本依然低廉,市場也不斷擴大,包括4億網路用戶
和7億手機用戶,但當地對外資的歡迎程度不斷降低。
 谷歌公司(Google)因智慧財產遭到侵犯和網路審查問題而與中國政府出現緊張
關係一事,凸顯許多西方企業日益對中國方面感到不滿。未來美、中關係若因人民幣匯
率等問題而更加緊張,這些美國公司在中國的處境必然會更艱難。
 曾在柯林頓時期擔任美國亞太事務副助理國務卿的謝淑麗(Susan Shirk)說:
「無可避免,一段時間之後,他們會不再歡迎外資企業,也不再提供優惠待遇。但如今
我們連平等待遇都享受不到,我們面臨到他們為保護本國企業而設下的非關稅障礙。」
 正如谷歌一般,其他公司現正檢討在中國的業務。美國電子業預測師沙佛(Paul
Saffo)說:「我
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j*x
2
想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector,类似
clonetech的Tet-One system(据称是目前唯一的商品化载体),但是手头的载体系统
都是基于Invitrogen的pLenti系列的,不太想再换clonetech的kit了。
不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统,或者知道是否
可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲,合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以
及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可
以指点,非常感谢!
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j*x
3
类似这个载体

验可

【在 j****x 的大作中提到】
: 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector,类似
: clonetech的Tet-One system(据称是目前唯一的商品化载体),但是手头的载体系统
: 都是基于Invitrogen的pLenti系列的,不太想再换clonetech的kit了。
: 不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统,或者知道是否
: 可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲,合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以
: 及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可
: 以指点,非常感谢!

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a*d
4
http://www.addgene.org/43914/
这个gateway vector行不?包装用三代的包装质粒就行,addgene上面有全部的包装系
统。

验可

【在 j****x 的大作中提到】
: 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector,类似
: clonetech的Tet-One system(据称是目前唯一的商品化载体),但是手头的载体系统
: 都是基于Invitrogen的pLenti系列的,不太想再换clonetech的kit了。
: 不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统,或者知道是否
: 可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲,合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以
: 及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可
: 以指点,非常感谢!

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T*u
5
https://www.addgene.org/21915/
这个就是pLKO-tetON
据说因为Clonetech 抗议,改成了 Tet-pLKO-puro
不用谢,我叫雷锋。

验可

【在 j****x 的大作中提到】
: 想构建一个单载体诱导表达系统single-vector Tet-inducible lentivector,类似
: clonetech的Tet-One system(据称是目前唯一的商品化载体),但是手头的载体系统
: 都是基于Invitrogen的pLenti系列的,不太想再换clonetech的kit了。
: 不知道有没有人基于pLenti载体构建过这种single-vector Tet-on系统,或者知道是否
: 可以在Addgene上找到类似的质粒。理论上讲,合成Tet-one上个那段包含Tet-on-3G以
: 及pTRE3GS-MCS的cassette然后置换掉pLenti载体上相应的区域即可。如果有人有经验可
: 以指点,非常感谢!

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Z*5
6
我最近也在为这事折腾呢。
我们最近买了pLKO-Tet-on,表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载
体也不会太大。
也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的,但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最
近还在纠结中。
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T*u
7
包装效率低

【在 Z******5 的大作中提到】
: 我最近也在为这事折腾呢。
: 我们最近买了pLKO-Tet-on,表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载
: 体也不会太大。
: 也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的,但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最
: 近还在纠结中。

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j*x
8
多谢诸位!
查了下前面给出的Addgene上的载体,感觉不是特别合适(表达shRNA和mRNA有一个很关
键的差别),最后还是决定自己手动改造了。根据Clonetech的pLVX-TetOne载体合成一
段大约3kb的cassette,置换到pLenti载体的backbone上,不含插入gene的话大概是9kb
,这样表达2kb以下的ORF应该问题不大,更大的插入就像铁牛所说,要严重影响包装效
率了。
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x*e
9
Plasmid 20321: TetO-FUW-OSKM , 我觉得这个挺好的,用PCR替换OSKM成自己
要表达的蛋白,刚刚订了个,试试看。

【在 Z******5 的大作中提到】
: 我最近也在为这事折腾呢。
: 我们最近买了pLKO-Tet-on,表达shRNA非常好用。整个载体10k多一点。插入shRNA后载
: 体也不会太大。
: 也考虑把这个载体promoter改成表达蛋白的,但是如果插入蛋白表达基因就会很大。最
: 近还在纠结中。

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m*z
10
all in one的lenti载体最致命的就是表达基因的长度有限,太长了会大大影响滴度。

【在 j****x 的大作中提到】
: 类似这个载体
:
: 验可

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m*z
11
那个公司会给你合成TRE3G promoter啊?里面有7个TRE repeat,合成难度很大哦。

9kb

【在 j****x 的大作中提到】
: 多谢诸位!
: 查了下前面给出的Addgene上的载体,感觉不是特别合适(表达shRNA和mRNA有一个很关
: 键的差别),最后还是决定自己手动改造了。根据Clonetech的pLVX-TetOne载体合成一
: 段大约3kb的cassette,置换到pLenti载体的backbone上,不含插入gene的话大概是9kb
: ,这样表达2kb以下的ORF应该问题不大,更大的插入就像铁牛所说,要严重影响包装效
: 率了。

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j*x
12
你说的没错,这类载体的插入片段大小非常受限,一旦超过2.5kb就很难包装了,如果
把WPRE等其他非必需element删除的话,大致包装极限能到3.5kb的样子。
能合成复杂重复序列的公司还是有的,稍微贵点儿而已。

【在 m*****z 的大作中提到】
: 那个公司会给你合成TRE3G promoter啊?里面有7个TRE repeat,合成难度很大哦。
:
: 9kb

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m*z
13
WPRE不是对表达量有影响吗?
删掉了差别大不大?内行的人来讲讲??

【在 j****x 的大作中提到】
: 你说的没错,这类载体的插入片段大小非常受限,一旦超过2.5kb就很难包装了,如果
: 把WPRE等其他非必需element删除的话,大致包装极限能到3.5kb的样子。
: 能合成复杂重复序列的公司还是有的,稍微贵点儿而已。

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s*s
14
用Adeno

【在 j****x 的大作中提到】
: 你说的没错,这类载体的插入片段大小非常受限,一旦超过2.5kb就很难包装了,如果
: 把WPRE等其他非必需element删除的话,大致包装极限能到3.5kb的样子。
: 能合成复杂重复序列的公司还是有的,稍微贵点儿而已。

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j*x
15
对于Tet-one系统,WPRE本身就不是调控你的target gene的,而是放在了resistance
gene和Tet-on 3G的后面,这个有或没有显然就影响不大了。

【在 m*****z 的大作中提到】
: WPRE不是对表达量有影响吗?
: 删掉了差别大不大?内行的人来讲讲??

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m*z
16
的确是。不过我自己做的lenti vector把WPRE放在了target gene后面,目的就是想增
加表达量,所以才有此一问。看来还是留着比较好?600左右长的片段,加减也不会影
响滴度太多吧,我想

【在 j****x 的大作中提到】
: 对于Tet-one系统,WPRE本身就不是调控你的target gene的,而是放在了resistance
: gene和Tet-on 3G的后面,这个有或没有显然就影响不大了。

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