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求问下怎么在96孔板里面screen point mutation？

求问下怎么在96孔板里面screen point mutation？# Biology - 生物学

s*r2014-08-27 07:08

1 楼

如果用surveyor assay的话会不会很贵？PCR产物直接做，还是要用96-well
purification kit再过一遍？不同孔的DNA浓度怎么normalize？
另外好像以前听说过可以用Taqman做realtime PCR based point mutation detection,
这个有成熟的方法么？
谢谢！

x*e2014-08-27 07:08

2 楼

你不放质粒里再筛？

detection,

【在 s********r 的大作中提到】

: 如果用surveyor assay的话会不会很贵？PCR产物直接做，还是要用96-well
: purification kit再过一遍？不同孔的DNA浓度怎么normalize？
: 另外好像以前听说过可以用Taqman做realtime PCR based point mutation detection,
: 这个有成熟的方法么？
: 谢谢！

s*r2014-08-27 07:08

3 楼

我可能没说清楚。96孔板里是挑的细胞 single colony。我想从里面筛到到genomic
DNA上带那个突变的细胞系。

【在 x********e 的大作中提到】

: 你不放质粒里再筛？
:
: detection,

x*e2014-08-27 07:08

4 楼

直接做genomic PCR啊
如果是random mutation的话我知道有人用realtime pcr去screen TALEN mutant
如果是有target的话，比如CRISPR，我身边也有人直接设计target site的primer，然后
普通pcr就筛出来了
听听其他有经验的同学怎么说

【在 s********r 的大作中提到】

: 我可能没说清楚。96孔板里是挑的细胞 single colony。我想从里面筛到到genomic
: DNA上带那个突变的细胞系。

s*g2014-08-27 07:08

5 楼

可以用digital PCR,参见下文。
Isolation of single-base genome-edited human iPS cells without antibiotic
selection
Yuichiro Miyaoka, Amanda H Chan, Luke M Judge, Jennie Yoo, Miller Huang,
Trieu D Nguyen, Paweena P Lizarraga, Po-Lin So & Bruce R Conklin
Nature Methods 11, 291–293 (2014) doi:10.1038/nmeth.2840

s*r2014-08-27 07:08

6 楼

这个有点厉害，多谢了。。

【在 s*****g 的大作中提到】

: 可以用digital PCR,参见下文。
: Isolation of single-base genome-edited human iPS cells without antibiotic
: selection
: Yuichiro Miyaoka, Amanda H Chan, Luke M Judge, Jennie Yoo, Miller Huang,
: Trieu D Nguyen, Paweena P Lizarraga, Po-Lin So & Bruce R Conklin
: Nature Methods 11, 291–293 (2014) doi:10.1038/nmeth.2840