请教qPCR时候primer efficiency的问题 - 未名空间MITBBS历史存档

请教qPCR时候primer efficiency的问题# Biology - 生物学

g*a2014-10-30 07:10

1 楼

今天买了一块希捷1T sshd,塞到一个外置硬盘盒里，连到一台dell e6530上，指示灯亮
了，说明连接没有问题，在computer management->device manager->usb controllers
里面也发现了usb mass storage device,可是在资源管理器里该硬盘的盘符就是不显示。
过路大神帮帮忙！

V*t2014-10-30 07:10

2 楼

是每个实验都要把efficiency算进去吗？
可是我看到，大部分人做qPCR检测mRNA变化的时候，是根本不做梯度稀释，计算
efficiency的。
哪种好啊？每次都算efficiency，工作量变大了。。。

g*t2014-10-30 07:10

3 楼

在disk management再assign一个盘符

Z*52014-10-30 07:10

4 楼

基本都不做的吧。一般就是设计至少两对引物就OK了。efficiency默认是2.

V*t2014-10-30 07:10

5 楼

这能准确吗
我用了文献的引物和 primer bank的引物，测试都是1.6-1.8。
看表达变化，加上efficiency，跟不加，计算出来的是有些差别的呐。

【在 Z******5 的大作中提到】

: 基本都不做的吧。一般就是设计至少两对引物就OK了。efficiency默认是2.

A*y2014-10-30 07:10

6 楼

No, you have to do it at least when you get the primers in to make sure they
are good, linear, and have a good range. If you do delta delta C(t) method
, you don't have to do it every run but checking is definitely necessary.
I know a lot of people don't do it, that's why you see NCS paper with mouse
primers using in human samples or primers flat out don't work. I know a big
lab in Harvard don't check their primers because half of their primers are
not efficient nor linear in their NCS papers. Karma and pubpeer will get
them soon.

【在 Z******5 的大作中提到】

: 基本都不做的吧。一般就是设计至少两对引物就OK了。efficiency默认是2.

V*t2014-10-30 07:10

7 楼

如果你检测，某target引物的efficiency是1.6，内参是1.9，那只用检测一次吧，以后
只要同时用内参和这个target都按1.9，1.6计算？
但是实际上每次不同的pcr，efficiency也会有变化的啊。难道每次都做个梯度稀释才
是最准确的？

they
method
mouse
big
are

【在 A******y 的大作中提到】

: No, you have to do it at least when you get the primers in to make sure they
: are good, linear, and have a good range. If you do delta delta C(t) method
: , you don't have to do it every run but checking is definitely necessary.
: I know a lot of people don't do it, that's why you see NCS paper with mouse
: primers using in human samples or primers flat out don't work. I know a big
: lab in Harvard don't check their primers because half of their primers are
: not efficient nor linear in their NCS papers. Karma and pubpeer will get
: them soon.

A*y2014-10-30 07:10

8 楼

The variability shouldn't be that great (less than 5%) or there is something
wrong with your procedure. To do absolute, I will recommend doing the
titration on the side every time.

【在 V******t 的大作中提到】

: 如果你检测，某target引物的efficiency是1.6，内参是1.9，那只用检测一次吧，以后
: 只要同时用内参和这个target都按1.9，1.6计算？
: 但是实际上每次不同的pcr，efficiency也会有变化的啊。难道每次都做个梯度稀释才
: 是最准确的？
:
: they
: method
: mouse
: big
: are

t*k2014-10-30 07:10

9 楼

原来大家做实验都这么粗放的呀。。。。
[在 Zifeng85 (Zifeng9527) 的大作中提到：]
：基本都不做的吧。一般就是设计至少两对引物就OK了。efficiency默认是2.

V*t2014-10-30 07:10

10 楼

是每个实验都要把efficiency算进去吗？
可是我看到，大部分人做qPCR检测mRNA变化的时候，是根本不做梯度稀释，计算
efficiency的。
哪种好啊？每次都算efficiency，工作量变大了。。。

Z*52014-10-30 07:10

11 楼

基本都不做的吧。一般就是设计至少两对引物就OK了。efficiency默认是2.

V*t2014-10-30 07:10

12 楼

这能准确吗
我用了文献的引物和 primer bank的引物，测试都是1.6-1.8。
看表达变化，加上efficiency，跟不加，计算出来的是有些差别的呐。

【在 Z******5 的大作中提到】

: 基本都不做的吧。一般就是设计至少两对引物就OK了。efficiency默认是2.

A*y2014-10-30 07:10

13 楼

No, you have to do it at least when you get the primers in to make sure they
are good, linear, and have a good range. If you do delta delta C(t) method
, you don't have to do it every run but checking is definitely necessary.
I know a lot of people don't do it, that's why you see NCS paper with mouse
primers using in human samples or primers flat out don't work. I know a big
lab in Harvard don't check their primers because half of their primers are
not efficient nor linear in their NCS papers. Karma and pubpeer will get
them soon.

【在 Z******5 的大作中提到】

: 基本都不做的吧。一般就是设计至少两对引物就OK了。efficiency默认是2.

V*t2014-10-30 07:10

14 楼

如果你检测，某target引物的efficiency是1.6，内参是1.9，那只用检测一次吧，以后
只要同时用内参和这个target都按1.9，1.6计算？
但是实际上每次不同的pcr，efficiency也会有变化的啊。难道每次都做个梯度稀释才
是最准确的？

they
method
mouse
big
are

【在 A******y 的大作中提到】

: No, you have to do it at least when you get the primers in to make sure they
: are good, linear, and have a good range. If you do delta delta C(t) method
: , you don't have to do it every run but checking is definitely necessary.
: I know a lot of people don't do it, that's why you see NCS paper with mouse
: primers using in human samples or primers flat out don't work. I know a big
: lab in Harvard don't check their primers because half of their primers are
: not efficient nor linear in their NCS papers. Karma and pubpeer will get
: them soon.

A*y2014-10-30 07:10

15 楼

The variability shouldn't be that great (less than 5%) or there is something
wrong with your procedure. To do absolute, I will recommend doing the
titration on the side every time.

【在 V******t 的大作中提到】

: 如果你检测，某target引物的efficiency是1.6，内参是1.9，那只用检测一次吧，以后
: 只要同时用内参和这个target都按1.9，1.6计算？
: 但是实际上每次不同的pcr，efficiency也会有变化的啊。难道每次都做个梯度稀释才
: 是最准确的？
:
: they
: method
: mouse
: big
: are

t*k2014-10-30 07:10

16 楼

原来大家做实验都这么粗放的呀。。。。
[在 Zifeng85 (Zifeng9527) 的大作中提到：]
：基本都不做的吧。一般就是设计至少两对引物就OK了。efficiency默认是2.

t*n2014-10-30 07:10

17 楼

一家之言：
我原来做过一批引物的效率，有variation, 比如你把cDNA反复冻融，或在4度放很长时
间。
大多数情况下，我们是用来测mRNA上调下调的，从2到1.8或1.6会影响比值，比如从10
倍，变成8或6倍，但上调或下调不会变。所以如果你比值是2或3的话，要特别小心。通
常，这个qPCR也并不是单一的证据。
所以，我们极少做每对引物的效率，太多了。很少数常用的引物，到可以验证。

【在 V******t 的大作中提到】

: 是每个实验都要把efficiency算进去吗？
: 可是我看到，大部分人做qPCR检测mRNA变化的时候，是根本不做梯度稀释，计算
: efficiency的。
: 哪种好啊？每次都算efficiency，工作量变大了。。。