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有人做过seahorse 测mito stress吗?
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r*k
2
班里有大神做过吗? 小弟做过两次 基本都是直线呀。。。。。好崩溃!不知道哪里错
了。 细胞前一晚上铺了六万个。 一共四个细胞系。。。都没啥太大反应。。。
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m*h
3
是xf24吗?6万细胞很多了,最好上张图。mito test 所用的试剂 oligomycin, FCCP/
CCCP等response 都非常强,没啥反应的话一般是基本试验体系的问题,比如试剂浓度
出现数量及的错误,或者inject 顺序出错,比如你把antimycin/rotenone 加到了A里
面,那么就什么都没有了。注意A/B/C/D的顺序。

【在 r******k 的大作中提到】
: 班里有大神做过吗? 小弟做过两次 基本都是直线呀。。。。。好崩溃!不知道哪里错
: 了。 细胞前一晚上铺了六万个。 一共四个细胞系。。。都没啥太大反应。。。

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r*g
4
上原始图~
我应该可以帮你troubleshoot一下
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L*T
5
搭车问一下:这机器贵么?
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A*y
6
I think around 150k-200k for the 96 well ones. I could be wrong. Good thing
that I don't have to buy one.

【在 L****T 的大作中提到】
: 搭车问一下:这机器贵么?
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d*s
7
感觉这机器稳定性不好?collaborator建议我们每个condition要有10个重复。
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L*T
8
好贵!如果不做高通量,有啥替代的选择?

thing

【在 A******y 的大作中提到】
: I think around 150k-200k for the 96 well ones. I could be wrong. Good thing
: that I don't have to buy one.

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g*a
9
除了一楼回答的原因,还有一个新手容易忽略的事。如果你买的是seahorse自己的mito
stress kit,它里面虽然每种试剂(不同颜色的管子)都有好几管,但是只有盖子上
画了seahorse的那管里面有东西,其他的只是给你分装用的。如果你稀释了空的管子,
当然加进去没反应了。以前别人弄错过。
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A*y
10
Clark electrode!

【在 L****T 的大作中提到】
: 好贵!如果不做高通量,有啥替代的选择?
:
: thing

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r*g
11
Seahorse XF24 我们这边买的好像是150K
挺贵的
一开始送了很多很多kits,如果自己买挺贵的
这个机器的稳定性非常不好,我一个24 well的plate 只能跑2个sample
意思就是1个sample 11个replicates....
你仔细读paper会发现,很多seahorse data里面给的stats都是+-SEM
你说的那种全部都是直线的情况:
1. 你的medium用的对不对?你用的seahorse自己的mito stress medium还是自己配的
?成分对不对?
2. 你的ABCD孔加对没? (可能性不大,不然不可能是一直直线)
3. 仔细读manual,inhibitor只有一个瓶子里面有powder,其他的瓶子都是空的
aliqouts,我们一般是180uL DMSO resuspension,然后,分装12个aliquots X 15uL (
kit送6个空瓶子?我们自己再准备6个)
也许你加到ABCD孔里面的全是DMSO,那就没用了
我很不喜欢seahorse这个机器,相当浪费钱和时间... 除非你有非常显著的phenotype
,否则 要花很多时间折腾稳定性的问题
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r*k
12
你好
我这些应该都没问题。我有个两种不同的细胞系。 A细胞系 完全没问题。 B细胞系(
我用的mouse ES cell),一样的protocol,什么都是一样的 就是最后一条直线。。。
。。不知道为什么。。

【在 r******g 的大作中提到】
: Seahorse XF24 我们这边买的好像是150K
: 挺贵的
: 一开始送了很多很多kits,如果自己买挺贵的
: 这个机器的稳定性非常不好,我一个24 well的plate 只能跑2个sample
: 意思就是1个sample 11个replicates....
: 你仔细读paper会发现,很多seahorse data里面给的stats都是+-SEM
: 你说的那种全部都是直线的情况:
: 1. 你的medium用的对不对?你用的seahorse自己的mito stress medium还是自己配的
: ?成分对不对?
: 2. 你的ABCD孔加对没? (可能性不大,不然不可能是一直直线)

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r*g
13
在使用各种inhibitor之前要做一个 各种inhibitor concentration的titration assay
你知道吧?
manual里面有
你要optimize你实验各种inhibitor的conc

【在 r******k 的大作中提到】
: 你好
: 我这些应该都没问题。我有个两种不同的细胞系。 A细胞系 完全没问题。 B细胞系(
: 我用的mouse ES cell),一样的protocol,什么都是一样的 就是最后一条直线。。。
: 。。不知道为什么。。

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A*y
14
This just a guess. First, if you baseline OCR is okay, it is likely that
mouse ES cells are more resistant to the inhibitors. A lot of so call stem
cells have their efflux pump at maximum and just pump the inhibitors right
out. That's why they are so hard to kill.

【在 r******k 的大作中提到】
: 你好
: 我这些应该都没问题。我有个两种不同的细胞系。 A细胞系 完全没问题。 B细胞系(
: 我用的mouse ES cell),一样的protocol,什么都是一样的 就是最后一条直线。。。
: 。。不知道为什么。。

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h*o
15
上个原始图 看看

【在 r******k 的大作中提到】
: 你好
: 我这些应该都没问题。我有个两种不同的细胞系。 A细胞系 完全没问题。 B细胞系(
: 我用的mouse ES cell),一样的protocol,什么都是一样的 就是最后一条直线。。。
: 。。不知道为什么。。

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