请教如何钓出这个蛋白？ - 未名空间MITBBS历史存档

请教如何钓出这个蛋白？# Biology - 生物学

t*12010-12-26 08:12

1 楼

昨天运行了一下统计。
boodbug这人嘴是真脏，基本每贴都是脏字。厕所捞出来的一样。
等我做几个关键词频率图给大家看看。还在找软件。
要搞，就要确保一棍子打死，我时间也有限，有网友表示愿意出力，再次深表感谢，我
会联系你们。
要搞，就把本版一帮人的做派全贴出来给全世界看看。
创业辞职的
人家不用Java方案就跳出来污言秽语的。
比30万40万比学校出身的
用NFLX内推拉帮结派的
我说过，顺便做一个社会学实验。呵呵。

s*e2010-12-26 08:12

2 楼

我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
抗体做western检测药物处理前后
的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
常明显。从分子量判断，这个条带
肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
不到那个70kD分子量位置有蛋白变
化。
我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

t*12010-12-26 08:12

3 楼

其实，搞还是会搞的。
而且，一定要搞得全NFLX看得见。

d*y2010-12-26 08:12

4 楼

我以前有过类似经验、姑且介绍、
你的判断比较一厢情愿、药物处理后、很难说会发生什么、会有特定现象通过WB显现出
来。
如果你一定认为这是个有意思的现象、值得追究、
不妨、
切条带做MS鉴定、了解到底是什么东西、然后再谈其他、
其次、如果是个有意思的现象、抗体染色可以尝试、但之前可用GFP tag之类的作萤光
live imaging
药物处理前后比较、
古得拉客

【在 s*******e 的大作中提到】

: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

s*e2010-12-26 08:12

5 楼

谢谢回复。
我也知道这个未知蛋白是不是真的有价值现在还很难说。我只是想试一下看看。
你说切条带是指从胶上切还是膜上切？如果是从胶上切的话，染色灵敏度不够看不到条
带。如果是从膜上切的话，我担心一抗，二抗附在条带上,MS很难鉴定。我对MS没有经
验，所以不知道我的担心是不是有道理。谢谢。

p*p2010-12-26 08:12

6 楼

从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。

【在 s*******e 的大作中提到】

: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

s*y2010-12-26 08:12

7 楼

有一个可能性是那个蛋白就是你想要的，只不过在处理后会表达出/或者被局部水解出
一个比较小的形式。
你可以试着用不同的protein A的抗体来看看，如果也能检测出那个带，应该就是了

【在 s*******e 的大作中提到】

: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

s*e2010-12-26 08:12

8 楼

谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体，并未检测到70kD的条带，所以我觉得
70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。

e*s2010-12-26 08:12

9 楼

另一个抗体检测不出来也不一定表示就不是那个130kD的降解产物，取决于抗体的识别
位点。
50kD以下有没有明显的条带呢？

【在 s*******e 的大作中提到】

: 谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体，并未检测到70kD的条带，所以我觉得
: 70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。

s*s2010-12-26 08:12

10 楼

//nod, 简洁明快, 标准做法.

【在 p****p 的大作中提到】

: 从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
: coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。

M*n2010-12-26 08:12

11 楼

run 2D gel before mass spec

【在 s******s 的大作中提到】

: //nod, 简洁明快, 标准做法.

s*s2010-12-26 08:12

12 楼

个人觉得没啥必要, 都已经affinity purify过一遍了, 2D有点over了.
另外, SDS-PAGE work的蛋白2D不一定work

【在 M*****n 的大作中提到】

: run 2D gel before mass spec

v*a2010-12-26 08:12

13 楼

正被mass spec弄得有点晕
看了几篇paper也不太知所云
这个说得真是简洁令人一目了然

【在 p****p 的大作中提到】

: 从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
: coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。

l*y2010-12-26 08:12

14 楼

make some informed guesses and screen gfp fusion strain libary

【在 s*******e 的大作中提到】

: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

c*y2010-12-26 08:12

15 楼

打击一下楼主，呵呵，不会是hsp70吧

s*e2010-12-26 08:12

16 楼

呵呵，即使是hsp70也算是新发现，因为以前并没有报道这个药物可以诱导hsp70表达

l*s2010-12-26 08:12

17 楼

It seems that the x protein is unrelated to A, why don't you do a direct microarray
to study differential expressions than sticking on protein X?

【在 s*******e 的大作中提到】

: 谢谢各位建议。我尝试过蛋白A的另外一个抗体，并未检测到70kD的条带，所以我觉得
: 70kD蛋白并不是蛋白A的另外一种形式。

t*p2010-12-26 08:12

18 楼

一般这种情况不值得深究。一个药物处理之后，显著变化的蛋白和mRNA不计其数，只是
恰巧有一个被你的抗体识别了。
用这个蛋白A的抗体的抗原序列做个搜索，先看看有没有大约70kd的同源蛋白。

【在 s*******e 的大作中提到】

: 我预期蛋白A（130kD）的表达水平会在药物处理细胞前后发生变化。所以我用蛋白A的
: 抗体做western检测药物处理前后
: 的变化，结果并没有观察到预期的变化。但有趣的是，有一个蛋白条带(70kD)的变化非
: 常明显。从分子量判断，这个条带
: 肯定不是蛋白A，很有可能是这个抗体的特异性不好而检测到的另外一个蛋白X。现在如
: 果我想鉴定蛋白X，请问有什么办
: 法？我曾尝试把药物处理后的样品跑电泳后染色比较。但是由于染色灵敏度的关系，看
: 不到那个70kD分子量位置有蛋白变
: 化。
: 我知道这里高人多多，所以特来请教如何可以鉴定出这个蛋白X?谢谢。

W*72010-12-26 08:12

19 楼

我认为IP不一定work，WB能识别，很多情况下IP不work。我曾经也想做过类似的东西，
合作人的建议是转膜然后，在膜上染色切带，测序。

c*r2010-12-26 08:12

20 楼

基本就是最好办法了。
除了Coomassie，也可以silver stain，更sensitive一点，也许可以cut得更准些。
但是我看其实这个追究的意义可能真的不大。不过想玩儿，就玩儿玩儿好了。

【在 p****p 的大作中提到】

: 从大量的细胞中提取总蛋白，用这个抗体免疫沉淀蛋白A和这个p70. 走SDS－PAGE，
: coomassie 染色，在70k那里割胶，mass spec。

C*42010-12-26 08:12

21 楼

我以前做过western之后的膜上酶切，再做质谱。中间有去除一抗和二抗的步骤，效果
还可以。

C*42010-12-26 08:12

22 楼

这篇文章，也许对你有帮助。
Luque-Garcia, J.L., Zhou, G., Spellman, D.S., Sun, T.T., and Neubert, T.A.
(2008). Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein
identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics 7, 308-314.

【在 C*4 的大作中提到】

: 我以前做过western之后的膜上酶切，再做质谱。中间有去除一抗和二抗的步骤，效果
: 还可以。

b*n2010-12-26 08:12

23 楼

哈哈，我也有同感，很可能是chaperone
取决于当初抗原怎么制备的

【在 c******y 的大作中提到】

: 打击一下楼主，呵呵，不会是hsp70吧

h*u2010-12-26 08:12

24 楼

T.A.
protein
This review might be helpful to you too.
Identification of Direct Protein Targets of Small Molecules
Brett Lomenick, Richard W. Olsen, and Jing Huang
http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cb100294v?
prevSearch=&searchHistoryKey=

【在 C*4 的大作中提到】

: 这篇文章，也许对你有帮助。
: Luque-Garcia, J.L., Zhou, G., Spellman, D.S., Sun, T.T., and Neubert, T.A.
: (2008). Analysis of electroblotted proteins by mass spectrometry: protein
: identification after Western blotting. Mol Cell Proteomics 7, 308-314.