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MD 干了好几天什么狗屁结果都没有 真崩溃!不想干了!
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MD 干了好几天什么狗屁结果都没有 真崩溃!不想干了!# Biology - 生物学
g*t
1
很多大牛看起来很强悍,很强势
走路横行,系里院里开会一个人占整张桌子,其他人龟缩到一角
写本子不是创系就是创研究中心,一将功成万骨枯
平时一副坚定地神情,眼神里包容一切的镇定,似乎指挥千军万马送死也在所不惜
其实真出了大事,也是胆小如鼠,瑟瑟发抖,救命稻草一般抓着亲人倾诉
“秦琼卖马,子胥吹箫,自古英雄,也曾困乏”
反倒冷暖时方见人心,肯施援手,共进退者才是真心师徒/朋友
有一个朋友,在mit做薄厚,一个人扛着一个实验室的活
老板当学生似的,一会不给写好的推荐信一会又怕人逼急了造反
又打又拉又骗又哄
朋友每次去问起H1B/EB之类移民事情,老板装作无辜,这些东西我不知道啊我不懂啊,
你去问HR啊
直到有一天,老板满脸心酸的坦诚
“我也用过J1...”
CV虽highly impressive,此等不为人道的苦楚,人生低处,不是自己人谁会告诉
My life is brilliant
My life is brilliant
My love is pure
I saw an angel
Of that I'm sure
She smiled at me on the subway
She was with another man
But I won't lose no sleep on that
'Cause I've got a plan
You're beautiful
You're beautiful
You're beautiful, it's true
I saw your face in a crowded place
And I don't know what to do
'Cause I'll never be with you
Yes, she caught my eye
As we walked on by
She could see from my face that I was
Fuckin' high
And I don't think that I'll see her again
But we shared a moment that will last 'til the end
You're beautiful
You're beautiful
You're beautiful, it's true
I saw your face in a crowded place
And I don't know what to do
'Cause I'll never be with you
La-la-la-la
La-la-la-la
La-la-la-la, la
You're beautiful
You're beautiful
You're beautiful, it's true
There must be an angel with a smile on her face
When she thought up that I should be with you
But it's time to face the truth
I will never be with you
https://www.youtube.com/watch?v=dW0YZBeMSWo
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r*k
2
MD 干了好几天 什么他妈结果都没有! 磷酸化的东西真他妈的碰不得!真他妈不想干
了! 擦擦擦擦擦!!!啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊
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l*r
3
如果不能到顶尖水平,或者能开公司赚钱
发考题的性价比很低

【在 g******t 的大作中提到】
: 很多大牛看起来很强悍,很强势
: 走路横行,系里院里开会一个人占整张桌子,其他人龟缩到一角
: 写本子不是创系就是创研究中心,一将功成万骨枯
: 平时一副坚定地神情,眼神里包容一切的镇定,似乎指挥千军万马送死也在所不惜
: 其实真出了大事,也是胆小如鼠,瑟瑟发抖,救命稻草一般抓着亲人倾诉
: “秦琼卖马,子胥吹箫,自古英雄,也曾困乏”
: 反倒冷暖时方见人心,肯施援手,共进退者才是真心师徒/朋友
: 有一个朋友,在mit做薄厚,一个人扛着一个实验室的活
: 老板当学生似的,一会不给写好的推荐信一会又怕人逼急了造反
: 又打又拉又骗又哄

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O*a
4
直接在细胞培养皿上,PBS洗过之后加裂解液+磷酸酶抑制剂,30s内移到冰上。封闭膜
和抗体要用BSA溶液,4度过夜。

【在 r******k 的大作中提到】
: MD 干了好几天 什么他妈结果都没有! 磷酸化的东西真他妈的碰不得!真他妈不想干
: 了! 擦擦擦擦擦!!!啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊

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k*k
5
想起我一朋友在某著名私立大学做了3年薄厚
老板只给RA的钱
有一天我朋友实在忍不住,主动提及涨工资的事
老板一脸懵懂“你只有这么低的工资么,我一直都以为给你的事薄厚待遇”
然后小秘悄悄说“别理他,你们每个月工资他都签字的”

【在 g******t 的大作中提到】
: 很多大牛看起来很强悍,很强势
: 走路横行,系里院里开会一个人占整张桌子,其他人龟缩到一角
: 写本子不是创系就是创研究中心,一将功成万骨枯
: 平时一副坚定地神情,眼神里包容一切的镇定,似乎指挥千军万马送死也在所不惜
: 其实真出了大事,也是胆小如鼠,瑟瑟发抖,救命稻草一般抓着亲人倾诉
: “秦琼卖马,子胥吹箫,自古英雄,也曾困乏”
: 反倒冷暖时方见人心,肯施援手,共进退者才是真心师徒/朋友
: 有一个朋友,在mit做薄厚,一个人扛着一个实验室的活
: 老板当学生似的,一会不给写好的推荐信一会又怕人逼急了造反
: 又打又拉又骗又哄

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r*k
6
谢谢 不过阿拉就是这么干的!!!!!! 主要这个蛋白的磷酸化 太TMD的恶心了!动
不动就丢失 妈的。。。。。。。。。。
我IP了以后blot pan-tyr也没有!。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。要疯呀。。。

【在 O**********a 的大作中提到】
: 直接在细胞培养皿上,PBS洗过之后加裂解液+磷酸酶抑制剂,30s内移到冰上。封闭膜
: 和抗体要用BSA溶液,4度过夜。

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t*k
7
我刚做了一次磷酸化的,然后没结果。现在看来不要做了
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O*a
8
Would you expect any improvement by using phos-tag gel?

【在 r******k 的大作中提到】
: 谢谢 不过阿拉就是这么干的!!!!!! 主要这个蛋白的磷酸化 太TMD的恶心了!动
: 不动就丢失 妈的。。。。。。。。。。
: 我IP了以后blot pan-tyr也没有!。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
: 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。要疯呀。。。

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l*a
9
抱歉,问一句,MD是什么?

【在 r******k 的大作中提到】
: MD 干了好几天 什么他妈结果都没有! 磷酸化的东西真他妈的碰不得!真他妈不想干
: 了! 擦擦擦擦擦!!!啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊啊

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f*d
10
IP 之前加SDS loading buffer 把lysate给煮了,或者收细胞的时候,直接收在SDS
loading buffer里面,总之越早煮了越好。然后稀释10倍或者20倍,再IP。
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x*e
11
哈哈,直接用热的protein loading buffer裂解吧,以前有个蛋白这么搞才出来。

【在 r******k 的大作中提到】
: 谢谢 不过阿拉就是这么干的!!!!!! 主要这个蛋白的磷酸化 太TMD的恶心了!动
: 不动就丢失 妈的。。。。。。。。。。
: 我IP了以后blot pan-tyr也没有!。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。
: 。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。。要疯呀。。。

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A*I
12
MD是:妈的

【在 l******a 的大作中提到】
: 抱歉,问一句,MD是什么?
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r*k
13
大神 请问我用10cm的dish,你要一次加多少loading buffer? 而且在loading buffer
里面IP????

【在 x*****e 的大作中提到】
: 哈哈,直接用热的protein loading buffer裂解吧,以前有个蛋白这么搞才出来。
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r*k
14
大神你好 比如我10cm的dish , 那加500ul sds loading buffer??? 然后收下来煮
了? 再IP? 但是这样也不能再稀释了把???

【在 f*******d 的大作中提到】
: IP 之前加SDS loading buffer 把lysate给煮了,或者收细胞的时候,直接收在SDS
: loading buffer里面,总之越早煮了越好。然后稀释10倍或者20倍,再IP。

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r*k
15
还想问一句,SDS loading buffer直接scrape下来的时候 是不是就不用加protease
inhibitor 还有 phospho-stop了??谢谢

【在 f*******d 的大作中提到】
: IP 之前加SDS loading buffer 把lysate给煮了,或者收细胞的时候,直接收在SDS
: loading buffer里面,总之越早煮了越好。然后稀释10倍或者20倍,再IP。

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r*k
16
你也是做IP吗? 因为现在没有识别这个蛋白磷酸化的抗体,我只能用IP pull down 然
后 做pan-tyr。 这个预热温度是多少? 然后你再加一抗over night?
PS:煮完了以后要放四度凉一会再加一抗把?谢谢

【在 x*****e 的大作中提到】
: 哈哈,直接用热的protein loading buffer裂解吧,以前有个蛋白这么搞才出来。
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r*k
17
你也是做IP吗? 因为现在没有识别这个蛋白磷酸化的抗体,我只能用IP pull down 然
后 做pan-tyr。 这个预热温度是多少? 然后你再加一抗over night?
PS:煮完了以后要放四度凉一会再加一抗把?谢谢

【在 x*****e 的大作中提到】
: 哈哈,直接用热的protein loading buffer裂解吧,以前有个蛋白这么搞才出来。
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r*k
18
大神们怎么都不会打了 小弟好急的啦
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x*e
19
哦, 我是直接做WB的,其实你可以看看别人提到的Phos-tag胶, “Would you expect
any improvement by using phos-tag gel?”, 搜kun-liang guang, 他的文章里用
的挺多的 。
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x*e
20
应该可以把, 50ml都可以 IP,估计得用IP 的buffer稀释。以前从酵母培养基上清纯
化蛋白大概就是这么搞的。

【在 r******k 的大作中提到】
: 大神你好 比如我10cm的dish , 那加500ul sds loading buffer??? 然后收下来煮
: 了? 再IP? 但是这样也不能再稀释了把???

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f*d
21
不好意思,今天才看到。
你直接加SDS-loading buffer, 里面含有protease 和 phosphotase inhibitor,然后
迅速刮下来煮了。 煮完之后sonicate, spindown 取supernatant, 测浓度。 然后用含
有protease inhibitor + phosphotase inhibitor 的lysis buffer, 或者PBS啥的稀
释, 10 倍或者20倍, 保证最终SDS浓度小于0.2%。 然后加抗体 4C 1h, 然后加Beads
4C overnight.
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r*k
22
HI 谢谢!! 但是加了loading buffer以后测浓度还准吗? sonicate以后不会影响磷
酸化吗??

Beads

【在 f*******d 的大作中提到】
: 不好意思,今天才看到。
: 你直接加SDS-loading buffer, 里面含有protease 和 phosphotase inhibitor,然后
: 迅速刮下来煮了。 煮完之后sonicate, spindown 取supernatant, 测浓度。 然后用含
: 有protease inhibitor + phosphotase inhibitor 的lysis buffer, 或者PBS啥的稀
: 释, 10 倍或者20倍, 保证最终SDS浓度小于0.2%。 然后加抗体 4C 1h, 然后加Beads
: 4C overnight.

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w*a
23
加足磷酸酶抑制剂,各种抑制剂一起加。裂解后(快速),快速IP(根据抗体情况,最
快5分钟),反正不要在buffer里待太久。如果可以绕过IP这一步,最好啦。
Phos-tag各种配方都用过,很tricky。很难跑出很好看的条带。
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r*k
24
最快五分钟啥意思? 裂解了以后五分钟就加抗体? 不是还是要overnight吗?

【在 w********a 的大作中提到】
: 加足磷酸酶抑制剂,各种抑制剂一起加。裂解后(快速),快速IP(根据抗体情况,最
: 快5分钟),反正不要在buffer里待太久。如果可以绕过IP这一步,最好啦。
: Phos-tag各种配方都用过,很tricky。很难跑出很好看的条带。

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